鸡精液稀释液中添加三种多糖对种蛋孵化率的影响

    何涛+赵娜

    

    摘要：采用腹背联合按摩法采集鸡精液，预处理后添加含有不同浓度的红景天多糖、枸杞多糖和海带多糖冷冻稀释液进行稀释，检测冷冻解冻后鸡精子的活率、质膜完整率、线粒体活性、顶体完整率。结果表明红景天多糖、枸杞多糖、海带多糖最佳添加量分别为1.00、0.75、0.50 mg/mL，精子冻后活率稳定在40%以上。

    关键词：鸡精液；红景天多糖；枸杞多糖；海带多糖；种蛋孵化率

    中图分类号：S814.3；S831 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2018）01-0005-02

    随着人们对禽类食品需求量的日益增加，中国养禽业规模化与集约化程度逐年提高，人工授精技术在养禽业得到了快速发展。笼养鸡的人工输精大多采用原精，但原精输精存在一定的缺陷，公鸡射精量少、精子密度大、在高温条件下体外存活时间短，在公鸡使用的早期和晚期易出现精液缺乏现象，鸡精液稀释技术可有效解决这类问题[1]。好的稀释液不仅可以提供精子生存活动的良好环境，并且将其稀释可以使密度高、容量低的鸡精液分布均匀，能够扩大其精液量，增强其授精能力[2]。本试验主要确定红景天多糖、海带多糖、枸杞多糖在鸡精液稀释液中的最佳作用浓度，以提高鸡人工输精后的种蛋孵化率和健雏率。

    1 材料与方法

    1.1 试验动物

    选择宁夏晓鸣农牧股份有限公司的冠大而鲜红、性反射功能好、精液品质符合要求的20只50周龄公鸡，根据日常输精划分为两组，两组公鸡轮换使用，采精2 d，休息1 d。

    1.2 试验仪器与试剂

    进口液氮罐（TAYLOR-WHARTON）；超纯水制备器（PureLabTMPlus，Pall公司，德国）；生物冷冻仪（BIOTRONICS LIMIED，英国）；倒置荧光显微镜（NIKON120型，日本）；全自动高速离心机（Heraeus，德国）；高压消毒柜（Thermo电子公司，美国）；保温水壶、冰箱、水浴锅等。

    D-葡萄糖（0188-500 g）、D-果糖（F2793-500 mg）、二水柠檬酸三钠（S4641-500 g）、柠檬酸（北京世纪星化工有限责任公司）、碳酸氢钠、Tris、EDTA、甘油、氯化钠、氯化钾、青霉素G钾（P-7794）、硫酸链霉素（0382-25 g）、甘油（0854-100 mL）、卵黃、碘化丙啶、罗丹明123、FITC-PNA、双蒸水等。

    红景天多糖标准品、枸杞多糖标准品、海带多糖标准品购自上海源叶生物公司。

    冷冻基础液TCG：葡萄糖1.1 g，柠檬酸1.48 g，Tris 2.42 g，青霉素钠0.06 g，硫酸链霉素0.1 g，加双蒸水至100 mL，调节pH至6.21，渗透压286 mOsm/L。

    精子低渗液：二水柠檬酸钠0.735 g，果糖1.351 g，加双蒸水至100 mL。

    冷冻保存I液：冷冻基础液加20%（V/V）的卵黄。

    冷冻保存II液：冷冻保存I液添加不同体积比的甘油。

    1.3 精液处理

    将合格的精液保存在保温壶（32～35 ℃）中，带回实验室后分装，按照所采精液密度的大小每个离心管分装5～10 mL，加等量的BTS液，纱布包裹，15 ℃下平衡3 h。800 g离心10 min，取出，弃上清。加入I液（80%TCG+20%卵黄），按1∶2稀释。在4 ℃下平衡3 h后，添加甘油使其最终浓度为3%，最终稀释倍数为1∶3。在4 ℃下平衡1～2 h。用细管分装，封口。然后放入程序冷冻仪中以1 ℃/min从5 ℃降到-5 ℃，迅速取出放置于自制冷冻盒中，在距液氮面3 cm处熏蒸3 min。将超低温温度计探针与冷冻槽连接，当温度降到-120 ℃时迅速投入液氮保存。解冻，放置37 ℃培养箱中待测。

    1.4 统计分析

    应用SPSS18.0软件进行显著性检验，数据均用平均数±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

    2 试验设计

    在试验中分别添加浓度梯度为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL红景天多糖、海带多糖、枸杞多糖，同时以TCG作为的对照，比较解冻后精子的活率、质膜完整率、线粒体活性、顶体完整率。

    3 结果与分析

    3.1 不同浓度红景天多糖对公鸡精子冷冻解冻效果的影响

    不同浓度红景天多糖对公鸡精子冷冻解冻效果的影响见表1。由表1可见，添加不同浓度梯度的红景天多糖均可提高公鸡精子冻后活率、质膜完整率，顶体完整率、线粒体活性等质量参数。其中以添加1.00 mg/mL的效果最好。

    3.2 不同浓度枸杞多糖对公鸡精子冷冻解冻效果的影响

    不同浓度枸杞多糖对公鸡精子冷冻解冻效果的影响见表2。由表2可见，添加不同浓度梯度的枸杞多糖均可提高公鸡精子冻后活率、质膜完整率，顶体完整率、线粒体活性等质量参数。其中以添加0.75 mg/mL的精子活率最高。

    3.3 不同浓度海带多糖对公鸡精子冷冻解冻效果的影响

    不同浓度海带多糖对公鸡精子冷冻解冻效果的影响见表3。由表3可见，添加不同浓度梯度的海带多糖均可提高公鸡精子冻后活率、质膜完整率，顶体完整率、线粒体活性等质量参数。其中以添加0.50 mg/mL的精子活率最高。

    4 小结与讨论

    红景天多糖主要用于免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、降血脂、和血糖、抗辐射、抗氧化、抗突变、耐缺氧及抗疲劳等[3]。枸杞多糖（LBP）是由阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，半乳糖和葡萄糖中性单糖和半乳糖醛酸及18种氨基酸等组成，作为传统的中草药提取物，具有抗衰老、抗氧化、抗细胞凋亡，调节血糖等多种生物活性[4]。海带多糖作为传统的中草药提取物，具有抗衰老、抗氧化、抗细胞凋亡，调节血糖等多种生物活性[5]。其原理是通过促进细胞脱水和在胞膜外形成保护膜来保持细胞的活性[6]。本试验结果表明，按不同浓度梯度在稀释液中添加0.25～1.25 mg/mL的红景天多糖、枸杞多糖和海带多糖可提高公鸡精子冻后活率、质膜完整率，顶体完整率、线粒体活性等质量参数。

    本试验将3种多糖应用到公鸡精子冷冻方面，试验结果令人惊喜，其对公鸡精子冷冻保存的保护作用可能源于多糖所具有的较强抗氧化性、抗衰老和防止细胞凋亡等特性，也可能是由于抑制了活性氧的产生，提高了过氧化物酶的活性，使细胞质膜免受脂质过氧化损伤，防止了细胞内酶类的外流[7]。但是多糖的构成成分复杂，结构多变，造成溶液的渗透压偏高，公鸡精子对渗透压较为敏感，所以应严格把握3种多糖的添加量。

    多糖用途广泛，主要用于免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、降血脂和血糖、抗辐射、抗氧化、抗突变、耐缺氧及抗疲劳等。红景天多糖、枸杞多糖、海藻多糖在很多领域都有相关的研究和探讨。本试验将其应用到公鸡精子冷冻方面，在公鸡的精液冷冻过程中，在传统的稀释液TCG基础上，添加红景天多糖、枸杞多糖、海带多糖均可以提高精子冻后活率、顶体完整性、线粒体活性和质膜完整率，与对照组比较差异显著（P<0.05），结果证实红景天多糖、枸杞多糖、海带多糖最佳添加量分别为1.00、0.75、0.50 mg/mL。 其中以1.00 mg/mL红景天多糖冷冻保护效果较好。

    参考文献：

    [1] 戴有理译.家禽精液稀释液的发展[J].中国家禽，1992，14（6）：34-36.

    [2] 韩雪峰，刘福注，杨长锁.公鸡精液稀释液的研究进展[J].甘肃畜牧兽医，2003（6）：40-43.

    [3] 邓胜国，尹爱武，田 润，等.大花红景天多糖的抗衰老作用[J].中国老年学，2014，34（8）：2161-2162.

    [4] 方建国，丁水平，田庚元.枸杞多糖药理作用与临床应用[J].医药导报，2004，23（7）：484-485.

    [5] 詹林盛，张新生，吴晓红，等.海带多糖的免疫调节作用[J].中国生化药物杂志，2001，22（3）：116-118.

    [6] 南向斌.三种多糖和冷冻平衡时间对牛精液冷冻效果影响的研究[J].陕西杨凌：西北农林科技大学，2010.

    [7] 张晓华，孙 鏖，易康乐，等.鸡精液稀释液配制及效果分析[J].中国家禽，2015，37（21）：71-73.