有氧运动对慢性应激大鼠空间学习记忆及海马齿状回BDNF表达的影响
崔建梅+杨文艳+药宏慧+于芳+薄媛媛+苏晓云+庞立杰
摘 要：通过研究跑台运动对慢性应激大鼠空间学习记忆能力及海马齿状回脑源性神经营养因子（BDNF）含量的改变，探讨有氧运动改善慢性应激大鼠认知能力的可能机制。方法：将健康成年Sprague-Dawley（8周）大鼠随机分为3组：正常对照组（C，n=10）、应激模型组（CUS，n=10）及应激运动组（CUS+E，n=10）3组，通过慢性不可预知应激建立大鼠抑郁模型。CUS+E组大鼠采取4周跑台运动，通过八臂迷宫实验观察跑台运动对应激大鼠学习记忆能力的影响；八臂迷宫实验结束后用ABC免疫组织染色法检测各组大鼠海马齿状回BDNF的分布。结果：与CUS组大鼠比较，CUS+ E组大鼠八臂迷宫实验中大鼠完成八臂迷宫探索时间（P<0.05）及进入放饵料臂平均潜伏期均显著缩短（P<0.05），参考记忆（P<0.05）及总记忆错误次数（P<0.05）均显著增多；海马DG区BDNF数量（P<0.05）及面积（P<0.05）均显著增多。结论：当前研究发现4周跑台运动可能通过激活海马DG区BDNF通路，增强海马DG区BDNF的表达，改善慢性应激大鼠的学习记忆能力。
关键词：跑台运动；学习记忆；海马DG；脑源性神经营养因子
中图分类号：G 804.2 学科代码：040302 文献标识码：A
Abstract： Objective： To observe the effects of treadmill exercise on the learning， memory and Hippocampal DG （dentate gyrus） BDNF （brain derived neurotrophic factor） expression in CUS （chronic unpredictable mild stress） rats and explore the possible mechanism of regular aerobic exercise to improve learning and memory. Methods： 30 adult SD （Sprague-Dawley） male rats were randomly assigned into 3 groups： control group （C）， chronic unpredictable stress group rats （CUS） and stress exercise group （CUS+E）. All rats were subjected to CUS except the control group. The learning and memory ability of rats were tested by radial arm maze test （CUS） after CUS+E group rats received 4-week treadmill exercise. Subsequently， ABC immunohistochemical staining detected BDNF expression in Hippocampus DG in every group rats. Results： Compared with the CUS group rats， the time of completing 8-arms radial maze and latency of entering into bait arms in ERM test significantly shortened （P<0.05， P<0.05）， reference memory errors and total memory errors in RAM test significantly decreased（P<0.05， P<0.05）； number and area of BDNF significantly increased in Hippocampal DG （P<0.05， P<0.05） in CUE+E group rats. Conclusion： The present experiment verified that 4-week treadmill exercise reverses stress-induced learning and memory impaired via an increase in BDNF signaling and may increase BDNF expression in Hippocampal DG.
Keywords： treadmill exercise； learning and memory； Hippocampal DG； BDNF
抑郁症是一种慢性、复发和潜在的威胁人类生命的情绪障碍性疾病。全世界抑郁发病率可能为17%[1]。尽管抑郁症是全球致残的主要病因，但其病理生理学机制仍不清楚。实验表明，认知障碍如学习记忆障碍是抑郁症的核心症状[2]。压力，尤其是长期反复接触的应激压力，会对行为和生理反应产生不良影响，也是抑郁症发病的主要原因之一；因此，慢性不可预知的应激压力（chronic unpredictable mild stress，CUS）模型已經被广泛地应用于模仿慢性抑郁症的病理发展及评估抗抑郁药的功效。研究认为，应激会导致一系列的生理、生化和大脑行为的改变，之前有研究表明长期慢性应激会通过增加糖皮质激素的分泌损害神经可塑性、学习和记忆过程[3]。许多动物实验表明，慢性应激可引起大鼠抑郁样行为改变，例如动物体质量下降、探索活动减少及减少对奖赏刺激的反应[3]，并且通过水迷宫及八臂迷宫证实，慢性应激暴露还可削弱大鼠的认知过程[4-5]。
在中枢神经系统中，海马是涉及重复或慢性应激引起神经可塑性异常的大脑区域之一，这些异常包括海马萎缩、神经发生减少及突触可塑性受损。海马齿状回（Hippocampal dentate gyrus，DG）对应激激素糖皮质激素尤其敏感，可以调节HPA轴的功能[6]，并且新近研究发现，海马DG神经元在提高或保持学习记忆能力方面扮演重要的角色，与学习记忆密切相关[7]。脑神经神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是神经生长因子家族的一员，在海马及前额叶皮质分布最为广泛，可以调节脑神经元的生存、突触传递及突触可塑性。多数学者认为BDNF的调节异常与抑郁症的病理发展有关。Karege等发现，重症抑郁病人血清BDNF水平下降，与抑郁评分量表得分呈负相关，并且与健康受试者的情绪障碍有关[8]。动物实验证实，大鼠经过应激刺激后，大脑某些区域BDNF mRNA及BDNF蛋白均显著减少[9]，并且有学者证实慢性抗抑郁药物治疗与BDNF信号通路有关，可以提高BDNF的合成。
研究认为，体育锻炼可以预防大脑细胞的老化、死亡、功能障碍及神经退行性疾病。此外，研究发现长期体育锻炼可以改善情绪及认知障碍[10]。虽然体育锻炼改善认知功能的确切机制仍有待阐明，但是多数学者认为运动对依赖海马的学习记忆的影响可能与海马神经发生、突触可塑性和神经营养因子，尤其是脑源性神经营养因子BDNF等有关。跑台运动的特征是让动物每天在有限的时间内运动，更类似于人的体育锻练。Aguiar等[11]研究表明，3～12周的跑台运动可以纠正应激对机体的不良影响及增强应激大鼠的学习记忆能力。本课题组的前期研究发现，长期跑台运动改善慢性应激大鼠学习记忆能力及海马CA1与CA3区BDNF的表达，但是运动对应激大鼠海马DG区BDNF的表达尚无相关研究；因此，本实验采取4周中等强度跑台运动，通过制备大鼠不可預知慢性应激模型（chronic unpredictable mild stress，CUS），探讨4周中等强度跑台运动改善CUS大鼠学习记忆能力是否与海马DG区BDNF的表达水平变化有关。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
30只雄性健康8周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠体质量200～220 g，饲养于中北大学动物饲养室（鼠笼规格：50 cm×26 cm×25 cm），湿度45%～65%，室温20 ～24 ℃，光照周期为12 h光照/12 h黑暗（昼夜颠倒除外），实验过程中大鼠可自由获得食物及饮水（除了必要的应激程序）。30只大鼠随机分为正常对照组C（control group，n=10）、应激模型组CUS（chronic stress group，n=10）及应激运动组CUS+E（chronic stress group treated with exercise group，n=10）3组，所有大鼠均单笼饲养。
1.2 CUS模型制备[12]
CUS组及CUS+E组大鼠从第2周开始每天上午（09：00—12：00）接受不可预知应激4周，根据以前学者描述的方法稍作修改，应激刺激包括7种温和刺激。为了使应激程序不可预知，每周随机安排7种应激程序顺序，见表1。
1.3 跑台训练安排
大鼠适应环境1周后，从第2周开始每天下午CUS+E组大鼠进行跑台训练（0坡度）4周[13]，见表2。
1.4 八臂迷宫测试
八臂迷宫实验[14]是评估动物学习记忆能力的常用模型之一，由八臂（每个臂：长41.9 cm，宽11.4 cm，高10.1 cm）组成；迷宫中央有一直径为27.4 cm的八角形区域。正式实验前，大鼠被放在迷宫中央八角形区域探索适应2 d（2次/d），八臂中距离2、4、6、8号臂末端1 cm处放置食物颗粒，允许其自由探索迷宫摄取臂中食物颗粒10 min。
正式实验前所有大鼠被限制饮食2 d，实验时按上述训练顺序4臂各放一颗饵料，关闭各臂门，将动物放在迷宫中央；15 s后将各臂门打开，让动物在迷宫中自由选择进入8臂中任何一臂摄取饵料（时间10 min）。测试指标：大鼠进入放食物臂潜伏期（s）、大鼠再次进入已经吃过饵料的臂为工作记忆错误次数（次）、动物进入不曾放饵料的臂为参考记忆错误（次）、总的错误次数（工作记忆错误次数+参考记忆错误次数）、测试时间与吃完所有饵料所花的时间（s），如果10 min饵料未吃完记为10 min。
1.5 海马组织取材及海马DG区BDNF免疫化学染色
学习记忆行为学测试结束后，大鼠被麻醉后（戊巴比妥钠，40 mg/kg）仰卧在手术台上，
手术剪开大鼠胸腔暴露心脏，灌胃针经心尖穿入主动脉，右心耳被剪开，快速灌入生理盐水（4 ℃）300 mL，随后先快后慢灌入4%的、PH7.4的4 ℃多聚甲醛150 mL，灌注结束后迅速用镊子开颅取脑，移至蔗糖溶液（4 ℃、30%）脱水。70%酒精30 min 1次、90%酒精30 min 2次及96% 酒精15 min 2次进行酒精梯度脱水，石蜡包埋后取冠状切面切片（片厚5 μm），进行BDNF免疫组织化学染色。为消除内源性过氧化物酶的活性双氧水（0.3箛）室温孵育30 min，于修复液中修复抗原，PBS 液冲洗3次×5 min，滴加BDNF一抗100 μL（1∶500），37 ℃恒温箱孵育3 h，PBS液冲洗后加入二抗（生物素标记的山羊抗兔），37 ℃恒温箱孵育30 min，加DAB 显色液显色12～15 min，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。
1.6 海马DG区BDNF图像分析
每只大鼠选择海马DG区切片3张，每张切片随机取 5 个不重叠（×400）视野观察海马DG区BDNF阳性细胞分布情况，用Olympus 显微镜采集图像，形态学图像分析系统对海马DG区BDNF的表达进行半定量分析。用海马DG区5个不同视野内BDNF免疫阳性细胞个数及面积的平均值表示每张切片BDNF的表达水平。
1.7 统计学方法
使用SPSS 18.0软件，采用单因素方差分析法对学习记忆指标及海马DG区BDNF表达进行组间差异比较，以P<0.05表示差异具有统计学意义。所有数据均采用平均数±标准差表示。
2 实验结果
2.1 跑台运动对CUS大鼠学习记忆能力的影响
与C组比较，CUS组大鼠进入放饵料臂平均潜伏期（96.67±34.56） s及完成八臂迷宫时间（281.30±144.62） s均显著延长（P<0.01，P<0.01），参考记忆错误次数（5.00±2.86）及工作记忆错误次数（4.24±2.28）均显著增加（P<0.05，P<0.01），总记忆错误次数（8.70±4.54）显著高于C组（P<0.01）；与CUS组比较，CUS+E组大鼠进入放饵料臂平均潜伏期（67.56±21.48） s及完成八臂迷宫时间（175.20±58.61） s均显著缩短（P<0.05，P<0.05），参考记忆错误次数（2.90±1.28）及总记忆错误次数（4.60±1.89）均显著减少（P<0.05，P<0.05），工作记忆错误次数（3.86±1.68）与CUS组大鼠比较无统计学意义（P>0.05）。见表3和图1所示。
2.2 跑台运动对CUS大鼠海马DG区BDNF表达的影响
与C组比较，CUS组大鼠海马DG区BDNF的表达显著减少，数量（9.89±2.34）个及面积（1110.84±213.95） μm2均显著下降（P<0.01，P<0.01），下降幅度分别为46.62%及45.94；经过4周跑台运动与CUS组大鼠比较，CUS+E组大鼠海马DG区BDNF的表达显著增加，BDNF数量（P<0.05）及面积（P<0.05）均显著增多，增加幅度分别为35.99%及20.16%。如图2、图3所示。
3 讨论
众所周知，应激对大脑及认知功能有很重要的调节作用，且应激与学习记忆及认知功能之间有很复杂的关系。研究表明，急性应激时与行为相关的大脑区域的神经元不会受损，并且可导致神经内分泌活动及中枢神经系统功能加强，而长期应激可产生一系列负面影响，神经功能会受到明显影响，包括认知功能[15]。Uysal等[16]研究发现，通过水迷宫实验证实大鼠经急性足底电击（1.6 mA）20 min大鼠学习记忆能力显著增强。临床研究证实，长期或严重的慢性应激会影响成人的学习记忆及认知功能。许多动物实验表明，CUS可引起动物出现类似于临床抑郁症的表现，例如蔗糖摄入量减少、体重增加、探索能力下降并减少奖励刺激[17]，另外，CUS暴露可以影响认知过程，如学习记忆能力下降；因此，可以认为，应激对学习记忆产生正面或负面影响或许与应激的持续时间、应激程度及类型有关。本研究通过八臂迷宫实验证实，经过28 d不可预知的应激，大鼠进入有食物的臂潜伏期延长，错误次数明显增多，说明长期应激显著削弱了大鼠的学习记忆能力，与前期学者研究一致。
多数研究表明，体育活动有益于大脑功能的神经保护，并且对在学习记忆过程中起重要作用的神经活动的变化、突触结构及重要神经递质的合成均有很重要的作用[18]。临床研究认为，体育活动可以逆转应激的有害影响，有效降低应激对机体的损害和改善抑郁患者的情绪障碍及认知功能[19]。Dimeo等[20]通过抑郁评分量表证实有氧锻炼可以降低中度及重度抑郁病人的抑郁评分。动物实验证实，慢性应激大鼠经过0坡度、速度8 m/min、每天30 min，连续6周的跑台运动可显著改善应激大鼠的学习记忆能力[21]。而Radahmadi等[22]发现规律的中等强度跑台运动在预防及治疗慢性应激引起的记忆障碍中均扮演重要角色。一些研究也表明，跑台运动可以提高学习和记忆的速度，增强认知功能。Radak等[23]研究认为动物在跑步机上跑步更类似于人类的运动锻炼，且最近的体外研究表明，中等强度跑台运动不会引起作为应激标记的皮质酮水平的升高[24]。因此，本研究选择的运动方式为中等强度跑台运动，结果发现与CUS组大鼠比较，CUS+E大鼠经过4周中等强度跑台运动八臂迷宫实验中进入有食物臂的潜伏期及完成迷宫探索时间均显著缩短，错误次数减少，提示跑台运动可显著改善CUS大鼠的学习记忆障碍，与上述学者研究结果一致。
研究认为，长期的应激刺激会通过改变海马的形态和功能影响学习记忆能力，而McKinnon等研究发现重症抑郁症患者海马体积减小；Kempermann等认为，成年人神经发生的特定区域在海马DG区，而有学者认为重症抑郁症患者DG区神经形成的减少与海马体积减小有关，并且抗抑郁药物治疗成功与否与神经形成的增多有关[25]。Travis等[26]研究表明海马DG区体积的大小在重症抑郁症患者中起着关键作用，并且与抑郁症患者认知功能的下降密切相关。因此，本实验中我们聚焦于海马DG区域。脑源性神经营养因子BDNF在大脑中广泛分布，在海马DG区有较高表达，与神经元的生存、突触的生长及分化有关。Zhang等[27]研究表明海马BDNF与海马容量及记忆有关，易受各种精神疾病及慢性应激的影响。多数学者认为，应激刺激可以减弱海马、前额叶皮质等大脑区域BDNF的表达，而抗抑郁治疗可以增加这些区域BDNF的表达[28]。众所周知，BDNF涉及长时程增强，增强突触可塑性，与学习记忆的细胞机制有关。而抗抑郁药物慢性治疗可以明显逆转慢性应激导致的抑郁行为和认知参数的改变与海马BDNF的表达上调有关；因此，可以推测本实验中28 d CUS导致的大鼠学习记忆能力的下降与海马DG区BDNF的表达下降有关。实验表明，HPA轴功能紊乱与抑郁等情绪障碍有关，Liu等[29]认为慢性应激激活HPA轴导致皮质酮过度分泌在抑郁症的发病机制及神经生物学方面起重要作用。本课题组的前期研究也已经证实，海马是高浓度血浆皮质酮攻击的主要靶区，并且与应激性海马损伤过程有关，慢性应激时大量的皮质酮与海马中糖皮质激素受体结合，导致海马神经发生减少，突触可塑性受损，损伤长时程增强，导致学习记忆能力下降；并且慢性应激引起的皮质酮持续增加可能会通过影响海马腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性从而减少海马BDNF表达[30]。Pesic等[31]认为，给予外源性皮质酮可显著降低大鼠海马BDNF的表达。因此，血清皮质酮水平升高可能是导致CUS大鼠海马DG区BDNF表达下调的重要原因之一。
脑源性神经营养因子BDNF是运动对大脑是否有影响的重要调节因子。许多研究认为运动对中枢神经系统神经形成及认知功能改变与BDNF有关，并且BDNF对于有益于学习记忆的海马突塑性的调节尤其重要，神经营养因子水平的增加会降低海马神经元死亡和增强海马突触传递[32]。学者的前期研究表明，自愿或强迫的跑台运动均可以增加内源性神经营养因子如BDNF的水平[33]。Fang等[34]认为，跑台运动通过调节应激大鼠海马BDNF通路改善应激大鼠的学习记忆能力。本研究也证实了上述观点。研究表明，BDNF可以调节自由基代谢，增加谷胱甘肽氧化物酶（Gpx）及超氧化物歧化酶（SOD）等在神经元内的含量，对减轻神经元损伤起重要作用[35]。也有研究认为，BDNF可通过阻断细胞凋亡蛋白激酶3抑制细胞凋亡防止大脑损伤，提高脑缺血大鼠空间学习和记忆功能[36]。本课题组前期研究已经证实，4周中等强度跑台运动可显著降低慢性应激大鼠的血清皮质酮水平；因此，可以推测本实验中4周中等强度跑台运动增强CUS大鼠學习记忆能力可能与拮抗HPA轴功能亢进，减少血清皮质酮分泌，上调CUS大鼠海马DG区BDNF表达，从而增强海马抗氧化能力及抑制细胞凋亡有关，具体机制需进一步研究。
4 結论
本实验结果显示：长期慢性不可预知应激导致八臂迷宫实验中大鼠空间学习记忆能力下降、海马DG区BDNF表达减弱，提示海马BDNF信号通路的改变与慢性应激致大鼠学习记忆的损害有关。而4周中等强度跑台运动可以改善慢性应激导致的大鼠记忆损害，可能与规律运动激活海马BDNF信号通路，增强海马DG区BDNF的表达，增强海马神经元的营养从而削弱慢性应激对大鼠的脑损害有关；因此，本研究从分子学角度证实跑台运动在改善慢性应激导致的大鼠认知功能下降方面起重要的有益作用，具体机制需进一步研究。
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摘 要：通过研究跑台运动对慢性应激大鼠空间学习记忆能力及海马齿状回脑源性神经营养因子（BDNF）含量的改变，探讨有氧运动改善慢性应激大鼠认知能力的可能机制。方法：将健康成年Sprague-Dawley（8周）大鼠随机分为3组：正常对照组（C，n=10）、应激模型组（CUS，n=10）及应激运动组（CUS+E，n=10）3组，通过慢性不可预知应激建立大鼠抑郁模型。CUS+E组大鼠采取4周跑台运动，通过八臂迷宫实验观察跑台运动对应激大鼠学习记忆能力的影响；八臂迷宫实验结束后用ABC免疫组织染色法检测各组大鼠海马齿状回BDNF的分布。结果：与CUS组大鼠比较，CUS+ E组大鼠八臂迷宫实验中大鼠完成八臂迷宫探索时间（P<0.05）及进入放饵料臂平均潜伏期均显著缩短（P<0.05），参考记忆（P<0.05）及总记忆错误次数（P<0.05）均显著增多；海马DG区BDNF数量（P<0.05）及面积（P<0.05）均显著增多。结论：当前研究发现4周跑台运动可能通过激活海马DG区BDNF通路，增强海马DG区BDNF的表达，改善慢性应激大鼠的学习记忆能力。
关键词：跑台运动；学习记忆；海马DG；脑源性神经营养因子
中图分类号：G 804.2 学科代码：040302 文献标识码：A
Abstract： Objective： To observe the effects of treadmill exercise on the learning， memory and Hippocampal DG （dentate gyrus） BDNF （brain derived neurotrophic factor） expression in CUS （chronic unpredictable mild stress） rats and explore the possible mechanism of regular aerobic exercise to improve learning and memory. Methods： 30 adult SD （Sprague-Dawley） male rats were randomly assigned into 3 groups： control group （C）， chronic unpredictable stress group rats （CUS） and stress exercise group （CUS+E）. All rats were subjected to CUS except the control group. The learning and memory ability of rats were tested by radial arm maze test （CUS） after CUS+E group rats received 4-week treadmill exercise. Subsequently， ABC immunohistochemical staining detected BDNF expression in Hippocampus DG in every group rats. Results： Compared with the CUS group rats， the time of completing 8-arms radial maze and latency of entering into bait arms in ERM test significantly shortened （P<0.05， P<0.05）， reference memory errors and total memory errors in RAM test significantly decreased（P<0.05， P<0.05）； number and area of BDNF significantly increased in Hippocampal DG （P<0.05， P<0.05） in CUE+E group rats. Conclusion： The present experiment verified that 4-week treadmill exercise reverses stress-induced learning and memory impaired via an increase in BDNF signaling and may increase BDNF expression in Hippocampal DG.
Keywords： treadmill exercise； learning and memory； Hippocampal DG； BDNF
抑郁症是一种慢性、复发和潜在的威胁人类生命的情绪障碍性疾病。全世界抑郁发病率可能为17%[1]。尽管抑郁症是全球致残的主要病因，但其病理生理学机制仍不清楚。实验表明，认知障碍如学习记忆障碍是抑郁症的核心症状[2]。压力，尤其是长期反复接触的应激压力，会对行为和生理反应产生不良影响，也是抑郁症发病的主要原因之一；因此，慢性不可预知的应激压力（chronic unpredictable mild stress，CUS）模型已經被广泛地应用于模仿慢性抑郁症的病理发展及评估抗抑郁药的功效。研究认为，应激会导致一系列的生理、生化和大脑行为的改变，之前有研究表明长期慢性应激会通过增加糖皮质激素的分泌损害神经可塑性、学习和记忆过程[3]。许多动物实验表明，慢性应激可引起大鼠抑郁样行为改变，例如动物体质量下降、探索活动减少及减少对奖赏刺激的反应[3]，并且通过水迷宫及八臂迷宫证实，慢性应激暴露还可削弱大鼠的认知过程[4-5]。
在中枢神经系统中，海马是涉及重复或慢性应激引起神经可塑性异常的大脑区域之一，这些异常包括海马萎缩、神经发生减少及突触可塑性受损。海马齿状回（Hippocampal dentate gyrus，DG）对应激激素糖皮质激素尤其敏感，可以调节HPA轴的功能[6]，并且新近研究发现，海马DG神经元在提高或保持学习记忆能力方面扮演重要的角色，与学习记忆密切相关[7]。脑神经神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是神经生长因子家族的一员，在海马及前额叶皮质分布最为广泛，可以调节脑神经元的生存、突触传递及突触可塑性。多数学者认为BDNF的调节异常与抑郁症的病理发展有关。Karege等发现，重症抑郁病人血清BDNF水平下降，与抑郁评分量表得分呈负相关，并且与健康受试者的情绪障碍有关[8]。动物实验证实，大鼠经过应激刺激后，大脑某些区域BDNF mRNA及BDNF蛋白均显著减少[9]，并且有学者证实慢性抗抑郁药物治疗与BDNF信号通路有关，可以提高BDNF的合成。
研究认为，体育锻炼可以预防大脑细胞的老化、死亡、功能障碍及神经退行性疾病。此外，研究发现长期体育锻炼可以改善情绪及认知障碍[10]。虽然体育锻炼改善认知功能的确切机制仍有待阐明，但是多数学者认为运动对依赖海马的学习记忆的影响可能与海马神经发生、突触可塑性和神经营养因子，尤其是脑源性神经营养因子BDNF等有关。跑台运动的特征是让动物每天在有限的时间内运动，更类似于人的体育锻练。Aguiar等[11]研究表明，3～12周的跑台运动可以纠正应激对机体的不良影响及增强应激大鼠的学习记忆能力。本课题组的前期研究发现，长期跑台运动改善慢性应激大鼠学习记忆能力及海马CA1与CA3区BDNF的表达，但是运动对应激大鼠海马DG区BDNF的表达尚无相关研究；因此，本实验采取4周中等强度跑台运动，通过制备大鼠不可預知慢性应激模型（chronic unpredictable mild stress，CUS），探讨4周中等强度跑台运动改善CUS大鼠学习记忆能力是否与海马DG区BDNF的表达水平变化有关。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
30只雄性健康8周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠体质量200～220 g，饲养于中北大学动物饲养室（鼠笼规格：50 cm×26 cm×25 cm），湿度45%～65%，室温20 ～24 ℃，光照周期为12 h光照/12 h黑暗（昼夜颠倒除外），实验过程中大鼠可自由获得食物及饮水（除了必要的应激程序）。30只大鼠随机分为正常对照组C（control group，n=10）、应激模型组CUS（chronic stress group，n=10）及应激运动组CUS+E（chronic stress group treated with exercise group，n=10）3组，所有大鼠均单笼饲养。
1.2 CUS模型制备[12]
CUS组及CUS+E组大鼠从第2周开始每天上午（09：00—12：00）接受不可预知应激4周，根据以前学者描述的方法稍作修改，应激刺激包括7种温和刺激。为了使应激程序不可预知，每周随机安排7种应激程序顺序，见表1。
1.3 跑台训练安排
大鼠适应环境1周后，从第2周开始每天下午CUS+E组大鼠进行跑台训练（0坡度）4周[13]，见表2。
1.4 八臂迷宫测试
八臂迷宫实验[14]是评估动物学习记忆能力的常用模型之一，由八臂（每个臂：长41.9 cm，宽11.4 cm，高10.1 cm）组成；迷宫中央有一直径为27.4 cm的八角形区域。正式实验前，大鼠被放在迷宫中央八角形区域探索适应2 d（2次/d），八臂中距离2、4、6、8号臂末端1 cm处放置食物颗粒，允许其自由探索迷宫摄取臂中食物颗粒10 min。
正式实验前所有大鼠被限制饮食2 d，实验时按上述训练顺序4臂各放一颗饵料，关闭各臂门，将动物放在迷宫中央；15 s后将各臂门打开，让动物在迷宫中自由选择进入8臂中任何一臂摄取饵料（时间10 min）。测试指标：大鼠进入放食物臂潜伏期（s）、大鼠再次进入已经吃过饵料的臂为工作记忆错误次数（次）、动物进入不曾放饵料的臂为参考记忆错误（次）、总的错误次数（工作记忆错误次数+参考记忆错误次数）、测试时间与吃完所有饵料所花的时间（s），如果10 min饵料未吃完记为10 min。
1.5 海马组织取材及海马DG区BDNF免疫化学染色
学习记忆行为学测试结束后，大鼠被麻醉后（戊巴比妥钠，40 mg/kg）仰卧在手术台上，
手术剪开大鼠胸腔暴露心脏，灌胃针经心尖穿入主动脉，右心耳被剪开，快速灌入生理盐水（4 ℃）300 mL，随后先快后慢灌入4%的、PH7.4的4 ℃多聚甲醛150 mL，灌注结束后迅速用镊子开颅取脑，移至蔗糖溶液（4 ℃、30%）脱水。70%酒精30 min 1次、90%酒精30 min 2次及96% 酒精15 min 2次进行酒精梯度脱水，石蜡包埋后取冠状切面切片（片厚5 μm），进行BDNF免疫组织化学染色。为消除内源性过氧化物酶的活性双氧水（0.3箛）室温孵育30 min，于修复液中修复抗原，PBS 液冲洗3次×5 min，滴加BDNF一抗100 μL（1∶500），37 ℃恒温箱孵育3 h，PBS液冲洗后加入二抗（生物素标记的山羊抗兔），37 ℃恒温箱孵育30 min，加DAB 显色液显色12～15 min，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。
1.6 海马DG区BDNF图像分析
每只大鼠选择海马DG区切片3张，每张切片随机取 5 个不重叠（×400）视野观察海马DG区BDNF阳性细胞分布情况，用Olympus 显微镜采集图像，形态学图像分析系统对海马DG区BDNF的表达进行半定量分析。用海马DG区5个不同视野内BDNF免疫阳性细胞个数及面积的平均值表示每张切片BDNF的表达水平。
1.7 统计学方法
使用SPSS 18.0软件，采用单因素方差分析法对学习记忆指标及海马DG区BDNF表达进行组间差异比较，以P<0.05表示差异具有统计学意义。所有数据均采用平均数±标准差表示。
2 实验结果
2.1 跑台运动对CUS大鼠学习记忆能力的影响
与C组比较，CUS组大鼠进入放饵料臂平均潜伏期（96.67±34.56） s及完成八臂迷宫时间（281.30±144.62） s均显著延长（P<0.01，P<0.01），参考记忆错误次数（5.00±2.86）及工作记忆错误次数（4.24±2.28）均显著增加（P<0.05，P<0.01），总记忆错误次数（8.70±4.54）显著高于C组（P<0.01）；与CUS组比较，CUS+E组大鼠进入放饵料臂平均潜伏期（67.56±21.48） s及完成八臂迷宫时间（175.20±58.61） s均显著缩短（P<0.05，P<0.05），参考记忆错误次数（2.90±1.28）及总记忆错误次数（4.60±1.89）均显著减少（P<0.05，P<0.05），工作记忆错误次数（3.86±1.68）与CUS组大鼠比较无统计学意义（P>0.05）。见表3和图1所示。
2.2 跑台运动对CUS大鼠海马DG区BDNF表达的影响
与C组比较，CUS组大鼠海马DG区BDNF的表达显著减少，数量（9.89±2.34）个及面积（1110.84±213.95） μm2均显著下降（P<0.01，P<0.01），下降幅度分别为46.62%及45.94；经过4周跑台运动与CUS组大鼠比较，CUS+E组大鼠海马DG区BDNF的表达显著增加，BDNF数量（P<0.05）及面积（P<0.05）均显著增多，增加幅度分别为35.99%及20.16%。如图2、图3所示。
3 讨论
众所周知，应激对大脑及认知功能有很重要的调节作用，且应激与学习记忆及认知功能之间有很复杂的关系。研究表明，急性应激时与行为相关的大脑区域的神经元不会受损，并且可导致神经内分泌活动及中枢神经系统功能加强，而长期应激可产生一系列负面影响，神经功能会受到明显影响，包括认知功能[15]。Uysal等[16]研究发现，通过水迷宫实验证实大鼠经急性足底电击（1.6 mA）20 min大鼠学习记忆能力显著增强。临床研究证实，长期或严重的慢性应激会影响成人的学习记忆及认知功能。许多动物实验表明，CUS可引起动物出现类似于临床抑郁症的表现，例如蔗糖摄入量减少、体重增加、探索能力下降并减少奖励刺激[17]，另外，CUS暴露可以影响认知过程，如学习记忆能力下降；因此，可以认为，应激对学习记忆产生正面或负面影响或许与应激的持续时间、应激程度及类型有关。本研究通过八臂迷宫实验证实，经过28 d不可预知的应激，大鼠进入有食物的臂潜伏期延长，错误次数明显增多，说明长期应激显著削弱了大鼠的学习记忆能力，与前期学者研究一致。
多数研究表明，体育活动有益于大脑功能的神经保护，并且对在学习记忆过程中起重要作用的神经活动的变化、突触结构及重要神经递质的合成均有很重要的作用[18]。临床研究认为，体育活动可以逆转应激的有害影响，有效降低应激对机体的损害和改善抑郁患者的情绪障碍及认知功能[19]。Dimeo等[20]通过抑郁评分量表证实有氧锻炼可以降低中度及重度抑郁病人的抑郁评分。动物实验证实，慢性应激大鼠经过0坡度、速度8 m/min、每天30 min，连续6周的跑台运动可显著改善应激大鼠的学习记忆能力[21]。而Radahmadi等[22]发现规律的中等强度跑台运动在预防及治疗慢性应激引起的记忆障碍中均扮演重要角色。一些研究也表明，跑台运动可以提高学习和记忆的速度，增强认知功能。Radak等[23]研究认为动物在跑步机上跑步更类似于人类的运动锻炼，且最近的体外研究表明，中等强度跑台运动不会引起作为应激标记的皮质酮水平的升高[24]。因此，本研究选择的运动方式为中等强度跑台运动，结果发现与CUS组大鼠比较，CUS+E大鼠经过4周中等强度跑台运动八臂迷宫实验中进入有食物臂的潜伏期及完成迷宫探索时间均显著缩短，错误次数减少，提示跑台运动可显著改善CUS大鼠的学习记忆障碍，与上述学者研究结果一致。
研究认为，长期的应激刺激会通过改变海马的形态和功能影响学习记忆能力，而McKinnon等研究发现重症抑郁症患者海马体积减小；Kempermann等认为，成年人神经发生的特定区域在海马DG区，而有学者认为重症抑郁症患者DG区神经形成的减少与海马体积减小有关，并且抗抑郁药物治疗成功与否与神经形成的增多有关[25]。Travis等[26]研究表明海马DG区体积的大小在重症抑郁症患者中起着关键作用，并且与抑郁症患者认知功能的下降密切相关。因此，本实验中我们聚焦于海马DG区域。脑源性神经营养因子BDNF在大脑中广泛分布，在海马DG区有较高表达，与神经元的生存、突触的生长及分化有关。Zhang等[27]研究表明海马BDNF与海马容量及记忆有关，易受各种精神疾病及慢性应激的影响。多数学者认为，应激刺激可以减弱海马、前额叶皮质等大脑区域BDNF的表达，而抗抑郁治疗可以增加这些区域BDNF的表达[28]。众所周知，BDNF涉及长时程增强，增强突触可塑性，与学习记忆的细胞机制有关。而抗抑郁药物慢性治疗可以明显逆转慢性应激导致的抑郁行为和认知参数的改变与海马BDNF的表达上调有关；因此，可以推测本实验中28 d CUS导致的大鼠学习记忆能力的下降与海马DG区BDNF的表达下降有关。实验表明，HPA轴功能紊乱与抑郁等情绪障碍有关，Liu等[29]认为慢性应激激活HPA轴导致皮质酮过度分泌在抑郁症的发病机制及神经生物学方面起重要作用。本课题组的前期研究也已经证实，海马是高浓度血浆皮质酮攻击的主要靶区，并且与应激性海马损伤过程有关，慢性应激时大量的皮质酮与海马中糖皮质激素受体结合，导致海马神经发生减少，突触可塑性受损，损伤长时程增强，导致学习记忆能力下降；并且慢性应激引起的皮质酮持续增加可能会通过影响海马腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性从而减少海马BDNF表达[30]。Pesic等[31]认为，给予外源性皮质酮可显著降低大鼠海马BDNF的表达。因此，血清皮质酮水平升高可能是导致CUS大鼠海马DG区BDNF表达下调的重要原因之一。
脑源性神经营养因子BDNF是运动对大脑是否有影响的重要调节因子。许多研究认为运动对中枢神经系统神经形成及认知功能改变与BDNF有关，并且BDNF对于有益于学习记忆的海马突塑性的调节尤其重要，神经营养因子水平的增加会降低海马神经元死亡和增强海马突触传递[32]。学者的前期研究表明，自愿或强迫的跑台运动均可以增加内源性神经营养因子如BDNF的水平[33]。Fang等[34]认为，跑台运动通过调节应激大鼠海马BDNF通路改善应激大鼠的学习记忆能力。本研究也证实了上述观点。研究表明，BDNF可以调节自由基代谢，增加谷胱甘肽氧化物酶（Gpx）及超氧化物歧化酶（SOD）等在神经元内的含量，对减轻神经元损伤起重要作用[35]。也有研究认为，BDNF可通过阻断细胞凋亡蛋白激酶3抑制细胞凋亡防止大脑损伤，提高脑缺血大鼠空间学习和记忆功能[36]。本课题组前期研究已经证实，4周中等强度跑台运动可显著降低慢性应激大鼠的血清皮质酮水平；因此，可以推测本实验中4周中等强度跑台运动增强CUS大鼠學习记忆能力可能与拮抗HPA轴功能亢进，减少血清皮质酮分泌，上调CUS大鼠海马DG区BDNF表达，从而增强海马抗氧化能力及抑制细胞凋亡有关，具体机制需进一步研究。
4 結论
本实验结果显示：长期慢性不可预知应激导致八臂迷宫实验中大鼠空间学习记忆能力下降、海马DG区BDNF表达减弱，提示海马BDNF信号通路的改变与慢性应激致大鼠学习记忆的损害有关。而4周中等强度跑台运动可以改善慢性应激导致的大鼠记忆损害，可能与规律运动激活海马BDNF信号通路，增强海马DG区BDNF的表达，增强海马神经元的营养从而削弱慢性应激对大鼠的脑损害有关；因此，本研究从分子学角度证实跑台运动在改善慢性应激导致的大鼠认知功能下降方面起重要的有益作用，具体机制需进一步研究。
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