松江鲈鱼线粒体Cytb基因分析及其在种质鉴定中的应用

    魏建军 尤宏争 夏苏东 范国伟 高哲颖

    

    

    

    摘要：为研究松江鲈鱼的遗传变异情况，以期对该鱼种质鉴定探索依据，采用PCR方法对11尾松江鲈鱼的线粒体Cytb基因进行扩增、测序的方法，进而构建系统发育树。结果表明松江鲈鱼属间遗传距离明显大于同一属内的种间遗传距离，形态生物学与杜父鱼类更加接近，进一步验证了松江鲈的分类地位为硬骨鱼纲、鲉形目、杜父鱼科，而并非是鲈形目的种类。松江鲈鱼Cytb基因序列的测出为遗传多样性和种质鉴定方面提供了参考数据。

    关键词：松江鲈鱼（TrachidermusfasciatusHeckel）;线粒体Cytb基因;种质鉴定

    松江鲈鱼（TrachidermusfasciatusHeckel），隶属于鲉形目，杜父鱼科，松江鲈鱼属，又名四鳃鲈、花鼓鱼、媳妇鱼等，主要分布于中国、菲律宾、日本以及朝鲜半岛[1]。松江鲈鱼味道鲜美，有着“江南第一名鱼”之美称，而且医用价值极高，《本草纲目》中有“松江鲈鱼，补五脏，益筋骨，和肠胃，益肝肾，治水气，安胎补中，多食宜人”[2-3]。因此，松江鲈鱼市场售价高达4000～6000元/kg，经济价值极高。但是，近几十年由于野生资源遭到严重破坏[4]，松江鲈鱼已被列为中国优先保护鱼类一级动物名录[5]，是国家二级保护动物[1]。

    细胞色素b（Cytochromeb，Cytb）是一种蛋白质，它是由线粒体基因编码而成，并且进化的速度较为适中，学者们一致认为它是解决分类和系统进化问题相当可信的一种分子标记，所以说线粒体Cytb基因是研究各种鱼类系统发育最普遍的分子标记[6]。

    1实验材料与方法

    1.1实验材料

    试验用松江鲈鱼于2017年8月采自天津水产研究所淡水试验站，试验鱼体长5～7cm，体重20～25g，共11尾，于-80℃冰箱保存备用。

    1.2实验方法

    取松江鲈鱼肌肉组织100mg左右，采用DNA提取试剂盒DNeasyBlood&TissueKit（德国，Qigen），按照试剂盒使用说明进行基因组DNA提取，并将沉淀后的DNA溶解于蒸馏水（100μL）中，以4℃的条件进行保存。用于扩增松江鲈鱼线粒体DNACytb基因的引物为SJ2F（5‘-ATCCCTGCTACAACCACCAA-3），SJ2R（5‘-GTAAAGTTGTCTGGGTCGCC-3）。PCR反应体系如表1所示。

    PCR的反应条件：在95℃的环境下运行5min，30s后退火，在72℃的环境下运行1min，具体反应体系见表1，总共进行30个循环，最后在72℃的环境下终延伸10min。选择扩增产物（2μL）于琼脂糖凝胶（1%）进行电泳分析，并委托北京中美泰和科技有限公司進行测序。

    1.3数据处理

    将测得的Cytb基因片段序列用MEGA5.2软件中ClustalW方法进行比对，并辅以人工校正。从GenBank库中下载10种杜父鱼的线粒体Cytb基因序列，以鲈鱼Cytb基因序列作为外围群，序列信息见表2。取下载物种Cytb基因5‘端756bp基因序列用于后续分析。使用DNAspv.5（LibradoandRozas2009）软件计算变异位点，简约信息位点数。使用MEGA5（Tamuraetal，2011）计算所得单倍型的碱基组成、单倍型间的转换颠换频率比值。利用MEGA5基于JC模型（Jukes-cantormodel，JC）计算遗传距离，并利用MEGA5中的邻接法（Neighbor-Joining）构建基于JC模型的进化树。利用MEGA5基于HKY+G模型（Hasgawa-Kishino-Yanomodel，GammaDistributed）计算各种间的遗传距离，并利用MEGA5中的邻接法（Maximumlikelihood）构建基于HKY+G模型的系统进化树，可靠性检验（Bootstrap）次数为1000次。

    2结果

    2.1松江鲈鱼Cytb序列

    经测序得到11尾试验松江鲈鱼的Cytb基因5‘端756bp的核酸序列（图1），该段序列共编码252个氨基酸（图2）。

    2.2序列特征分析

    松江鲈鱼的Cytb基因结构和一般的鱼类相似，A、C、G、T的相对平均值依次为23.4%、32.1%、16.8%、27.7%。通过对基因序列进行分析，可见松江鲈鱼的Cytb基因嘧啶比例显著大于嘌呤，且第2位密码子嘧啶含量显著大于嘌呤含量，具体见表3。第3位密码子表现出反G偏倚，恰恰显示出了脊椎动物的属性。

    获得的11条松江鲈鱼序列共含有保守位点750个，占序列长度的99.2%。变异位点6个，其中简约信息位点和单变异位点各占3个。这些基因序列共有6个位点发生转换，0个位点发生颠换，与Cytb基因具有遗传保守性相吻合，为种质鉴定提供必要条件。

    2.3遗传距离

    本试验采用Mega5软件，通过Kimura2-parameter双参数进化模型计算出杜父鱼科鱼类和鲈鱼Cytb基因序列的遗传距离，具体可见表4。结果显示，床杜父鱼属的棘头床杜父鱼和短角床杜父鱼的遗传距离最小（为0.061），其次为裸棘杜父鱼属的凹尾裸棘杜父鱼和宽额裸棘杜父鱼（为0.077）。吉氏杂鳞杜父鱼与鲈鱼的遗传距离最大（0.253）。松江鲈鱼与杜父鱼科的其他鱼类遗传距离较近，在0.166～0.206之间，与鲈形目鳍科鲈鱼的遗传距离较远（0.237）。以上结果表明松江鲈鱼属间遗传距离明显大于同一属内的种间遗传距离。

    2.4系统发育树

    通过邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，详细见图3。结果表明，鲈鱼作为外围群自成一支，松江鲈鱼与其他杜父鱼科鱼类聚成一支。在杜父鱼科中，松江鲈鱼组成了一个自展数据支持率高达100%的分支，恰恰说明了松江鲈鱼和试验所选择的杜父鱼亲缘较近，而与鲈鱼的“关系”最远。松江鲈常常被大家叫为鲈鱼，但实际上它与鲈鱼的形态生物学差异很明显，实则与杜父鱼类更加接近。试验结果验证了松江鲈的分类地位为硬骨鱼纲、鲉形目、杜父鱼科，而并非是鲈形目的种类。

    3结论

    松江鲈鱼Cytb基因序列的测出意义深远，尤其是为遗传多样性和种质鉴定方面提供了参考数据，促进该鱼的种质资源保护。本试验的成果也为其他鱼类的种质鉴定方法提供了依据。

    参考文献：

    [1]汪松.中国濒危鱼类动物红皮书（鱼类）[M].北京：科学技术出版社，1998.240-243.

    [2]邵炳绪.松江鲈的生态初步观察.复旦大学学报[J].1959（2）：213-218.

    [3]邵炳绪.唐子英，孙帼英.松江鲈鱼繁殖习性的调查研究[J].水产学报，1980，4（1）：81-86.

    [4]赵建国，盛伯生，顾红林，等.松江鲈鱼（四鳃鲈）的人工繁殖试验[J].水产科技情报，1974（6）：12-15.

    [5]“中国生物多样性保护行动计划”总报告编写组.中国生物多样性保护行动计划[M].北京：中国环境科学出版社，1994：83-84.

    [6]章唯才，周晓平，陈小麟.基于细胞色素b基因的彩鹬系统分类研究[J].厦门大学学报：自然科学版，2008，47：250-258.

    （收稿日期：2019-07-29）