基于分子对接技术模拟预测复明片对M胆碱受体的作用
黄丹梅 陈沛洪
摘? 要：【目的】采用分子对接技术模拟预测复明片与M胆碱受体的作用关系。【方法】建立复明片活性成分数据库，采用Autodocking vina等软件，以M胆碱受体蛋白激动剂 IX0作为配体，建立 M胆碱受体蛋白的活性位点，对复明片中活性成分进行分子对接模拟预测。【结果】以自带配体IX0（-6.5 kcal/mol）为阈值，复明片中共有217种成分与 M胆碱受体蛋白对接亲和力在阈值之上。复明片中活性成分主要作用于以ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111等氨基酸残基组成的活性位点。【讨论】复明片中活性成分与M胆碱受体蛋白能够成功进行分子对接，其对接位点信息有助于研究复明片活性物质与M胆碱受体的作用机制的阐释及发现新型抗青光眼药物提供参考。
关键词：复明片;活性成分;M胆碱受体蛋白;分子对接
中图分类号：R276? ? ? ? ?文献标志码：A? ? ? ? ?文章编号：2095-2945（2020）21-0005-04
Abstract： Objective： The molecular docking technology was used to simulate and predict the relationship between Fumingpian tablets and M choline receptors. Methods： We established the active ingredient database of Fumingpian tablets， used software such as Autodocking vina， and used M choline receptor protein agonist IX0 as a ligand， so as to establish the active site of M choline receptor protein and perform molecular analysis on the active ingredients in Fumingpian tablets Docking simulation prediction. Results： Taking the self-ligand IX0 （-6.5 kcal/mol） as the threshold， a total of 217 components in Fumingpian tablets have a docking affinity with M choline receptor protein above the threshold. The active ingredients in Fumingpian tablets mainly act on ALA-194， ASN-108， ASN-404， ASP-103， CYS-429， PHE-195， SER-107， TRP-155， TRP-400， TYR-403， TYR -426， TYR-430， VAL-111 and other active sites composed of amino acid residues. Discussion： The active components of Fumingpian tablets can successfully dock with M-choline receptor proteins， and the information of their binding sites is helpful to study themechanism of interaction between active substances and M-choline receptors， and provide a reference for the discovery of new anti-glaucoma drugs.
Keywords： Fumingpian tablets; active ingredients; M choline receptor protein; molecular docking
前言
青光眼是一種以眼压急剧升高并伴有相应症状和眼前段组织改变为特征的眼病，其易引起视力下降、视野缺损等后遗症，是一种致盲率较高的眼疾病。青光眼的致病原因是复杂的、多方面的，或与全身疾病有着密切的关系，目前尚有部分患者病因不明。例如急性闭角型青光眼，其发病急剧，视力可数日内迅速下降，甚至失明，而原发性闭角型青光眼则发病隐匿，进展缓慢，早期患者无自觉的症状，随着眼压长期对视神经的压迫造成损害，患者才会发现视力下降，此时视神经已经有了一定的损害了[1]。一般认为，高眼压、缺血等原发性损伤因素首先引起敏感性视网膜神经节细胞的崩解死亡，崩解产物致使躲过原发损伤的视网膜神经节细胞进入凋亡程序而最终丢失，它是青光眼患者视神经病变进展的最主要因素。对于本病的治疗目前主要是通过药物和手术来降低眼压及保护视神经药物以延缓青光眼的发病进程[2]。
复明片为补益类中成药，有滋补肝肾，养阴生津，清肝明目之功效。主治肝肾阴虚所致的畏光、视物模糊。适用于青光眼，初、中期白内障见上述证候者。临床研究证实服用复明片能有效改善青光眼患者高眼压及视神经损伤等症状;实验研究发现复明片水溶液给家兔滴眼可明显缩小瞳孔直径，降低眼内压的作用。因而我们大胆猜想，复明片的有效成分中可能有拟胆碱样作用的成分组存在[1，3，4]。
1 方法
1.1 试验药物
复明片总方的所有有效成分结构
1.2 使用软件
Atoudocking vina 1.1.2、Pymol 1.7、Atoudocktool-1.5.6
1.3 复明片总方分子数据库的建立
通过查找及中国天然产物化学成分库（http：//pharmdata.ncmi.cn/cnpc/）及TCMP数据库（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/index.php），检索复明片中中草药的化学成分。全方共计1181个化学成分，采用ChemBioDraw Ultra 12.0画出化合物LIN的结构，然后用ChemBio3D Ultra 12.0转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行优化，输出mol2结构，后通过Atoudocktool-1.5.6软件转变为.pdbqt格式。
1.4 作用靶点的选择
通过在TTD数据库搜索青光眼治疗靶点，搜索到M胆碱受体蛋白（PDB ID：4MQS）。在RCSB蛋白质数据库（www.rcsb.org）上，下载具有蛋白质-配体复合物的晶体，通过Atoudocktool-1.5.6及其附带的激动剂化合物确定作用位点的三维坐标。
1.5 分子对接模拟试验
本课题采用Atoudocking vina 1.1.2进行分子对接研究。按照以上坐标参数进行模拟对接。为了增加计算的准确度，我们将参数exhaustiveness设置为20。除了特别说明，其他参数均采用默认值。最后，选取打分值最高的几个构象用PyMoL 1.7进行结果分析[5-8]。
2 结果
通过Atoudocking vina 1.1.2批量对接可得到复明片1181个化合物，能与M胆碱受体蛋白有效的对接的化合物共611个，高于原激动配体的化合物共217个，占比约35.51%。将高于原激动配体的化合物亲和力的绝对值前10个化合物用pymol软件作图分析得到表1。选择对接活性较高，与活性口袋有氢键连接的neocnidilide及N-Salicylidene-salicylamine与原配体IX0作图对比。
蛋白的原配体IX0、neocnidilide及N-Salicylidene-salicylamine与M胆碱受体蛋白的分子对接图1表示IX0与M胆碱受体蛋白的分子对接图： 左图球棍状代表化合物，线条部分代表与化合物临近的氨基酸残基，飘带表示M胆碱受体蛋白。右图显示出了对接活性口袋及其二维图（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111）。
图2表示neocnidilide与M胆碱受体蛋白的分子对接图：左图球棍状代表化合物，线条部分代表与化合物临近的氨基酸残基，飘带表示M胆碱受体蛋白。右图显示出了对接活性口袋及其二维图（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-426、VAL-111、TYR-104）。
图3表示N-Salicylidene-salicylamine与M胆碱受体蛋白的分子对接图： 左图球棍状代表化合物，线条部分代表与化合物临近的氨基酸残基，飘带表示M胆碱受体蛋白。右图显示出了对接活性口袋及其二维图（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111、TYR-104）。
根据对比发现，复明片的活性物质均共同作用于同一群活性口袋：ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111。这些数据证明复明片的活性物质能有效作用M胆碱受体蛋白。
3 讨论
分子对接方法是依据受体学的“锁和钥匙”原理，从已知结构的受體和原配体出发，通过化学计量方法模拟、 识别并预测受体-配体复合物结构的方法[9]。该方法可以预测蛋白质复合物的结构和结合位点，在药物设计中具有重要作用，并已广泛用于药物虚拟筛选、定量构效关系研究[10]。复明片临床用于青光眼治疗由来已久，然而对其何种有效成分作用何种蛋白的研究却甚少，且分子对接模拟的研究报道不多。
治疗青光眼的机制有多种，如抑制β受体以减少房水的生成;激动M胆碱受体使之缩瞳从而促进房水流出[11]。有研究发现复明片的10%的水浸液对实验家兔的瞳孔有明显缩瞳作用和降低眼压作用，其可能有拟胆碱样作用。因而作者选用M胆碱受体蛋白与复明片的有效成分进行对接，探讨了复明片对于抗青光眼降眼压的潜在影响[1]。
M胆碱受体，又称M受体，能与毒蕈碱特异性结合并被激动的胆碱受体称为毒蕈碱型胆碱受体（muscarinic receptor，M受体），主要分布于节后胆碱能神经纤维所支配的效应器细胞膜上。拟胆碱药-毛果芸香碱主要作用于副交感神经（包括支配汗腺的交感神经）节后纤维支配的效应器官的M胆碱受体，滴眼后可引起缩瞳、降低眼压和调节痉挛等作用[1，12]。中药复明片为临床上常用的中成药，其抗青光眼的疗效已被证实。然而其抗青光眼的机制却鲜有人研究。作者通过分子对接预测其有效成分中拟胆碱样作用的成分，发现复明片成分中共有217个有高于原蛋白激动配体的作用。其中以neocnidilide、（+）-alpha-Curcumene、beta-Bisabolen等有效成分对M胆碱受体有较高的亲和力。这些对接信息将为研究新型抗青光眼拟胆碱药提供参考依据。
4 结论
复明片中的有效成分有三成可与M胆碱受体对接，这预示复明片的有效成分可能对M胆碱受体有效，且其中部分有效成分有比原配体更高的结合力，其结构可作为将来新的拟胆碱药的设计母体。
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