奶牛乳房炎诊断方法研究进展

    薛永康+王新庄+闫跃飞+杨文华+任小丽+闫磊

    摘要：奶牛乳房炎是造成奶牛业损失最主要的原因。随着科学技术的发展与应用，奶牛乳房炎的诊断方法也有了长足的发展。特别是现代生物技术在微生物检测领域应用之后，奶牛乳房炎的诊断周期大大缩短、操作简单快捷、检测成本降低、灵敏度提高。环介导等温扩增（LAMP）技术在奶牛乳房炎主要病原诊断中的应用也极大地推动了奶牛乳房炎检测技术的发展。

    关键词：奶牛；乳房炎；诊断方法；PCR；基因芯片；LAMP

    中图分类号：S858.23 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2016）08-0015-03

    奶牛乳房炎（Bovine mastitis）是由病原微生物感染而引起的乳房组织及乳头发炎的一种疾病，是造成奶牛业经济损失最主要的原因[1]。在中国，奶牛乳房炎每年造成的经济损失无法估量。奶牛患病后，不但造成产乳量和乳品质的下降，而且，还可能造成奶牛产后发情期和妊娠期延长，甚至危及人类健康。

    1 概述

    奶牛乳房炎，又称奶牛乳腺炎，是一种由病原微生物感染、机械性伤害、物理性损伤和化学物质刺激所引起的较为复杂的奶牛乳腺综合征疾病，也是奶牛发病率最高、造成损失最严重的疾病之一。长期以来，该病一直困扰着中国乃至世界乳业发展，它不仅引起奶产量下降，而且严重影响乳的品质，甚至危害到人类的健康。美国乳房炎委员会（NMC）在1978年，根据乳汁和乳房的肉眼可见变化情况，将乳房炎分为隐性乳房炎和临床型乳房炎两种，其中隐性乳房炎占总发病的77%～79%，临床型乳房炎占奶牛总发病的21%～23%。

    1.1 临床型乳房炎

    临床型乳房炎症状明显，轻者表现为乳房皮肤发红、乳汁稀薄，有少量絮状物，用手触摸患牛乳房，患牛乳房疼痛不明显。重者表现为精神萎靡，食欲减退，体温升高，产奶量明显下降，乳汁稀薄且乳汁内混有大量絮状物、凝乳块或血液，乳区质地硬、肿胀，手触患牛疼痛明显。因此，临床型乳房炎根据临床表现的症状，极易做出判断。

    1.2 隐性乳房炎

    隐性乳房炎不表现临床症状，乳汁也无肉眼可见的变化，只是产奶量下降，实验室检测乳汁略偏碱性，体细胞数多达5×105 个/mL以上。

    2 诊断

    奶牛乳房炎要早诊断、早治疗，以降低养殖户的经济损失。

    2.1 病原微生物检查

    乳房炎主要由多种非特定的病原微生物引起，如细菌、真菌、病毒等。较常见的有27种，其中细菌12种，霉形体2种，真菌和病毒7种。病原微生物的分离培养和鉴定是实验室诊断奶牛乳房炎病原的一种重要方法，它不仅可以鉴别病原种类也能确定细菌的数量。首先将无菌采集的新鲜奶样接种于培养基，经细菌培养、乳汁涂片、革兰氏染色、镜检等反复纯化病原菌。然后，对已经纯化的细菌用全自动细菌鉴定仪进行鉴定。选择性培养基的应用，也提高了病原分离鉴定的效率。如改良爱德华培养基（Modified Edwards Medium Base，MEM）用于选择性分离链球菌、却普曼琼脂（Chapman Agar，CA）用于选择性分离金黄色葡萄球菌、麦康凯培养基（Mac Conkey Agar，MCA）用于选择性分离肠杆菌、PPLO培养基（Pleuropneumonia-Like Organisms，PPLO）用于选择性分离支原体、脑心浸液培养基（Brian Heart Infusion，BHI）和血平板培养基（Blood Agar，BA）用于病原菌盲筛。

    病原微生物分离鉴定法只能根据检测出病原菌的种类、数量对乳房炎发病情况进行大致判断。从分离培养到利用全自动细菌鉴定仪鉴定需24 h才能确诊，该方法对实验操作人员要求较高且检测速度较慢。

    2.2 乳汁体细胞检测

    奶牛发生乳房炎后，白细胞数显著增加，这是因为在乳腺受到细菌感染后，细菌的代谢产物诱导大量的多形核白细胞（PMN）进入乳腺细胞，随后损伤脱落的上皮细胞也进入乳中，致使乳汁中的体细胞增加。所以，奶牛是否患有隐性乳房炎可以通过检测乳汁中体细胞数目来判断。

    国外专家发明了直接显微镜计数法来推断体细胞数目，明确规定乳汁中体细胞数超过5×105个/mL可诊断为乳房炎。但是，中国农科院中兽医研究所根据试验，提出治疗乳房炎判定疗效标准，每毫升乳汁中细胞数降至1×106个/mL以下就可定为正常。

    CMT（加州乳房炎测试法），在CMT试液的作用下，乳汁细胞中的脂类物质发生乳化，乳汁细胞被破坏，释放出的DNA发生沉淀或凝块，根据其量的多少来间接判定乳中细胞数的多少而达到诊断的目的方法[2]。有学者在现有各种诊断方法的比较试验的基础上，采取各种不同新合成的国产表面活性剂组成多种配方进行筛选，选定了SMT-Ⅰ，SMT-Ⅱ，SMT-Ⅲ3种隐性乳房炎诊断液。试验结果表明，SMT系列诊断液反应敏感，尤其是SMT-Ⅰ试液，只需5s即可显示结果。其他间接检验，有2%苛性钠凝乳法和过氧化氢酶法。过氧化氢酶法是通过检测白细胞中的过氧化氢酶来推断乳中白细胞含量的。

    2.3 乳汁pH检查

    泌乳奶牛乳汁的正常pH在6.2～6.6之间，且碱性会随着乳房炎症状的加剧而升高。原因在于牛奶pH值的变化与体细胞和炎性细胞的含量呈正相关，随着炎症反应的加重，血管渗透性增加，导致牛乳pH逐渐升高，因此可以通过检测乳汁pH值的方法来检测乳房炎[3，4]。现在这种诊断方法已在美、法、德等国家多个牧场作为检测和控制奶牛乳房炎的重要措施进行推广。在国内，研究人员研制的奶牛乳房炎pH试纸已经在牧场应用和推广。日本研制出以乳汁中分离出的乳清为检测样品的BPB滤纸片诊断乳房炎的方法。有关专家对BPB法进行进一步改进，利用试验证明，全乳BPB诊断法的准确性可靠而且灵敏性较高。

    2.4 乳汁导电性检查

    奶牛乳腺有炎症后，乳腺上皮细胞造乳糖功能下降，血-乳屏障的渗透性改变，致使血液成分渗入乳汁的能力加强，乳汁中的Na+、Cl-、K+和Ca2+进入乳汁，使乳汁电导率值升高[5]。乳汁电导率法是通过检测乳汁的电导率的变化来监测奶牛乳房炎的。研究表明，奶牛乳房炎乳汁的电导率均高于正常值，但在不同的个体及不同的饲养管理状况下，乳汁的电导率变化较大，因此，判断隐性乳房炎的关键是确定不同牛群正常乳汁电导率的阈值[6]。

    1983年，山西农业大学郝庆铭教授研制出同类型奶牛乳房炎诊断仪，命名为SX-IE型。随后，他又研制出具有国际领先水平的ZRD（以前称CN）型乳牛乳腺炎电子检测仪。ZRD型乳牛乳腺炎电子检测仪重量轻，体积小，可在牛舍旁进行测定。相信随着科技的发展，畜牧科研人员一定能研究出诊断更为准确，便于操作和掌握的新方法，为奶牛养殖户做出贡献。

    2.5 酶检验法

    酶检测法是目前国内外奶牛乳房炎诊断方法的研究热点之一。乳房炎会导致乳汁中一些酶的生物活性升高，例如乳酸脱氢酶（LDH）、黄嘌呤氧化酶L8J、过氧化氢酶、N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶、β葡糖苷酸和乳酸过氧化氢酶（LP）等，其活性与SCC的相关性很高[7]。其中一些酶（如过氧化氢酶、NAGnse和抗胰蛋白酶）的活性变化特点已用于诊断奶牛乳房炎及评价奶牛乳房炎的健康状况[8]。

    2.6 PCR检测

    PCR技术检测法是一种在分子水平分离和检测乳房炎主要病原的方法，基于细菌rRNA操纵元 16S rRNA和23S rRNA间隔区序列的PCR技术作为一种新的细菌分类和鉴定方法[9]得到了广泛的应用，并取得了较好的应用效果。该方法优点是对某些细菌不经过培养过程，直接用奶样就可以进行细菌学鉴定，减少了病原菌间的所需的时间和费用，经济有效、快速、准确、特异性强，具有重要的应用价值[10，11]。张普瑞等[12]在对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌3种主要的乳房炎致病菌建立多重PCR检测时发现多重PCR方法的特异性为100%，最低检测浓度为1.25×103 CFU/mL，充分证明了该方法具有快速、准确和特异性的优点。Riffon等[13]研制出用PCR方法检测诱发乳房炎的6种病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和副乳房链球菌）的技术。

    2.7 被毛微量元素检测法

    田凤林等[14]在研究微量元素含量与乳房炎的相关性时发现患有乳房炎的奶牛乳汁中Cu、Fe、Co和Zn含量显著低于正常乳汁（P<0.05或P<0.01），乳房炎与微量元素含量具有相关性。还有研究发现隐性乳房炎奶牛被毛中的Zn、Co、Mn的含量比正常牛只有一定相关性，隐性乳房炎病牛被毛中Zn、Ca显著低于正常牛被毛中含量。但是，由于个体差异、营养、季节等影响，该诊断方法并不是非常准确，还有待进一步地研究。

    2.8 蛋白质组学检测法

    蛋白质组学（Proteomics）是基因组学的重要组成部分，在功能基因组学研究中占据重要地位，近年来对白细胞蛋白质组学、差异蛋白组学、病原微生物蛋白组学等的研究有了突破性的进展，使得蛋白质组学成为诊断乳房炎的一个新的研究热点。

    2.9 基因芯片检测法

    基因芯片技术可以实现多种病原微生物的同时检测，大大缩短了奶牛乳房炎的诊断时间，使那些不能培养或很难培养的病原微生物也能被快速检出[15]。邢会杰等[16]建立了一套基于16S rRNA的检测奶牛乳房炎4种主要致病菌（无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌）的基因芯片方法，通过对杂交条件进行优化，研制了与之相应的价格低廉、易于推广的小型操作平台，其检测灵敏度是PCR检测的10倍。目前，国外已有商品化的奶牛乳房炎专用基因芯片，它可以同时检出包含7种导致奶牛乳房炎的细菌，即金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛链球菌和牛支原体，在组装的试剂盒中包括了能从DNA提取到的基因芯片的所有试剂，使检测程序标准化，并且可以在6 h内得到检测结果[17]。2009年，李守军等[18]以大肠杆菌16S rRNA保守区为基底序列，在6种奶牛乳房炎主要致病菌（无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌）的可变区域内设计了特异性寡核苷酸杂交探针，发明了奶牛乳房炎主要致病菌的检测基因芯片，该技术操作步骤简单，便于推广使用。

    2.10 LAMP快速分子诊断法

    环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是在体外等温条件下进行的、一种新型的用于扩增特异性核酸片段的方法，为2000年日本荣研株式会社学者Notomi等人所发明。该反应只需耍将链置换型DNA合成酶、引物、基因模板、反应液共同置于一定的温度条件下（60～65 ℃），经一个反应步骤即可完成。该技术突破了传统的PCR技术需耍多个循环变温，即每个循环进行热变性以获得单链DNA模板、反复升温降温实现退火、延伸的耗时过程，LAMP技术实现并完成了在恒温条件下进行核酸DNA的连续快速扩增的目的，且具有相较于普通PCR更为高效的扩增效率与灵敏度。

    由于LAMP两对引物在设计时针对于靶基因DNA链上的6个特异性的区域位点，因而极大提高了LAMP扩增反应的特异性，且只需根据扩增反应产物的有无、即可确认靶基因序列是否存在。LAMP扩增产物可通过传统常规的核酸电泳、焦磷酸镁浊度检测、简易直视的荧光目测比色进行结果判断。LAMP技术简单、快速、特异性强，作为崭新的核酸扩增方法，摆脱了昂贵复杂的仪器设备和反应试剂的限制，反应时间短，检测结果判断简单，十分利于在基层机构推广与应用。目前，以LAMP技术为代表的分子快速诊断技术已日渐成熟，并已经在人类生命医学领域中被广泛应用，但在动物疫病诊断与防控中的应用目前尚不多见，发展潜力巨大。

    目前，国内已经有了商品化的基于LAMP技术基因芯片，该芯片上有24个反应室，其中包含16种引起奶牛乳房炎的主要病原菌、2种耐药基因、阴阳性对照各1个以及4个空白室。该芯片采用人工提取核酸，机器校准核酸浓度，实时浊度仪监测反应室浓度变化等方法来快速鉴别诊断病原菌，整个过程仅需4 h。

    3 小结

    奶牛乳房炎发病急，造成损失快，如何能够快速准确地诊断该病一直是奶牛业的首要难题。现阶段降低奶牛乳房炎的发生的主要措施有：抗病奶牛选育、提高饲养管理和及时地诊断治疗。其中抗病奶牛选育是一个长期的过程，目前有不少学者在研究预防乳房炎的疫苗，虽然有一定效果，但并不理想[15]。因此，提高饲养管理和及时诊断治疗成为目前控制乳房炎发病的关键。随着分子生物技术的发展，PCR、LAMP等分子诊断技术作为一种检测方法在奶牛乳房炎、尤其是隐性乳房炎上表现出巨大的诊断潜力。应用分子生物学技术进行早期、快速、准确地诊断将成为控制奶牛乳房炎的趋势，这对于奶牛乳房炎的诊疗十分关键，应用前景广阔。

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