细菌和微藻作用下石油-矿物颗粒聚集体的形成及特性
郝树廷 韩璐 张明远 刘丽
摘?要：在海洋中，石油-矿物颗粒团聚体（Oil-Mineral Aggregation，OMA）在油的纵向迁移及去除中发挥重要作用。采用模拟实验研究了细菌、微藻及菌藻共同作用下OMA的形成及特性。结果表明与无菌条件下生成的油滴状OMA相比，菌、藻作用下生成的OMA有丝状、纤维状、网状和球状，且OMA生成速率加快，最快3 h即生成。OMA的沉降速率随时间延长逐渐变快。菌藻共同作用下OMA沉速最大，且胞外聚合物透明颗粒（Transparent Exopolymer Particles，TEP）含量最大。
关键词：细菌;微藻;OMA;沉降速率;TEP
随着全球石油产品需求的增加和海洋石油运输量的加大，海上溢油事故频繁发生。溢油可与海洋中的矿物颗粒相互作用形成油-矿物颗粒聚集体OMA并发生沉降，继而影响溢油的环境行为。以往的研究中主要考察了不同物化因素对OMA的影响，对微生物作用下OMA的形成及其特性研究的较少。本研究通过模拟实验，分别研究了细菌、微藻及菌藻共同作用下OMA的形成及特性。
1?材料与方法
1.1?实验材料
由蒸馏水和海水素按一定比例配制盐度为35‰的人工海水，pH=7.8;实验用油为青岛石化厂轻质原油;采用捷菲特001溢油分散剂使溢油迅速乳化分散;采用高岭土来模拟海洋中的悬浮颗粒物，实验用高岭土平均密度为2.6 g/cm3，平均粒徑为2.25 μm。
在青岛小港码头近岸海域取石油污染海水，人工海水培养基和微量元素混合液用于石油烃降解菌的富集培养[1];每日定时测其OD600值，绘制细菌生长曲线，选取对数生长期后期的培养菌液制备菌悬液。
以青岛大扁藻为代表性微藻，培养大扁藻所用海水取自青岛鲁迅公园附近海滨，经0.45 μm滤膜过滤，121 ℃高压蒸汽灭菌，冷却后待用。配制营养液：采用f/2培养基[2-3]，在指数生长期接种，培养温度20±1 ℃，光照强度1 200 lx，光暗周期12 h∶12 h。每天摇动锥形瓶数次，避免大扁藻黏附于瓶壁。
1.2?实验设计
取12个容积为250 mL的锥形瓶，分别加入100 mL人工海水，加入5 mg高岭土，121 ℃高压蒸汽灭菌、冷却，分别向锥形瓶内准确加入经0.22 μm滤膜过滤除菌的0.06 g轻质原油和10 μL分散剂，将上述锥形瓶分为4组，每组3个平行样，向第1组锥形瓶每瓶加入20 mL无菌水作为对照，第2组锥形瓶每瓶加入20 mL菌悬液，第3组锥形瓶每瓶加入20 mL大扁藻藻液，第4组锥形瓶内每瓶加入20 mL大扁藻藻液和20 mL菌悬液，pH调至8，盐度为35‰，将锥形瓶用高温灭菌的纱布密封，保证锥形瓶透气且不被外源菌污染，置于25 ℃、转速为160 r/min的恒温摇床振荡培养，观察锥形瓶内OMA形成情况并记录分析。
1.3?测定方法
（1）光密度（Optical Density，OD）法[4]测定细菌生长量。
（2）采用血球计数板对青岛大扁藻进行计数。
（3）利用石油尤其是油中多环芳烃类化合物在紫外灯照射下显荧光的原理，使用Olympus—IX83倒置荧光显微镜对OMA形态进行观察，比较分析OMA尺寸、形态等参数。
（4）用移液枪吸取肉眼可见的OMA絮体，并手持移液枪以与液面近乎平行的角度，缓慢将絮体注入含有人工海水的比色管中，拍摄并记录下其沉降过程，依据沉降距离和沉降时间，来计算其沉降速率[5]。
（5）TEP含量测定采用阿尔新蓝染色半定量分析法[6]。将阿尔新蓝染色后的样品置于光学显微镜100×倍观察，统计相同视野下直径大于50 μm的TEP的数量及表面积，总表面积越大TEP含量越高。
2?结果与讨论
2.1?生成速率与形态
无菌条件下，取培养至第7天的锥形瓶内溶液少许，置于荧光显微镜下观察。
如图1所示，观察到的OMA大多数是油滴状OMA，是由油滴表面包裹一层细小颗粒物高岭土或是油滴表面黏附高岭土的凝聚体构成。观察到的油滴状OMA有单滴状OMA，即OMA中只有单个油滴存在（如图1a所示），单滴状OMA中油滴直径在15～30 μm之间;溶液内也形成了多滴状OMA，即OMA中结合多个油滴形成（如图1b、c所示），多滴状OMA中油滴的尺寸较单滴状OMA中油滴偏小，直径约在5～20 μm之间。显微镜照片中，绿色显荧光的部分为油滴，油滴周围包裹的颜色较黑的部分为固体颗粒物高岭土。无菌条件下OMA在12 h内即可生成，尺寸为 μm级。
和无菌条件下形成的油滴状的OMA相比，细菌作用下形成的OMA生成速率快，在7 h内即可生成，OMA尺寸较大，少数絮体可达cm级（实验过程中观察到，此处未列出），而且荧光显微镜下，OMA的形态呈多样性，依据形态特征，主要分为以下4种（见图2）：丝状OMA、纤维状OMA、网状OMA和球状OMA。如图2a，丝状OMA：外形似盘曲的树枝，形态纤长，较松散，易破碎。图2b，纤维状OMA：结构密实，不易破碎，荧光性强，捕获油能力强。图2c，网状OMA：比丝状OMA和纤维状OMA松散，好似一张网将分散的油滴捕获在其中。图2d，球状OMA，形态相对规则，长、短径区别不大，大小一般在mm级，较网状OMA密实，较纤维状OMA松散，不易破碎，荧光性强，捕获的石油量较多。受水动力等其他因素的影响，由于OMA形态的易碎性，其形态会相互转变。
在细菌作用下，当足够多的高岭土黏附到油表面时会有一层油膜分离下来，形成尺寸较大的OMA，OMA是由固体颗粒物混合在油里形成，所以其大小、形态变化很大。丝状OMA和网状OMA看起来就像是膜一样，通常是漂浮或是悬浮在水中，宽度可以达到数mm，这种丝状OMA很容易被强剪切作用破坏。纤维状OMA和球状OMA结构紧凑，荧光性强，多沉降于锥形瓶底部。
在加入青岛大扁藻藻液的锥形瓶内取少许液体置于倒置荧光显微镜下观察。与无菌条件和细菌作用下形成的OMA相比，大扁藻作用下形成的絮体以丝状OMA（见图3）为主。由于矿物颗粒表面黏附石油，在明场下不易观察。形成的OMA对石油的捕获比较均匀，且微藻之间的孔隙，可能为分散石油、黏性物质及高岭土提供较好的反应场所。与前两种条件下形成的OMA相比，大扁藻作用下形成的OMA尺寸大，包裹油滴多，形态也不规则。实验观察到有一些死亡大扁藻包裹在OMA中，一定程度上增大了OMA的尺寸，还有一些大扁藻围绕在絮体周围，可能在OMA的聚集过程中发挥重要作用。
图4为石油烃降解菌与青岛大扁藻作用下形成的OMA在显微镜下的图片。OMA表面黏附少量油滴，周围分散着一些小絮体。与无菌条件、细菌和大扁藻单独作用下相比，细菌与大扁藻混合作用下OMA形成速率快，3 h内即可生成。OMA尺寸更大，显微镜明场条件下观察到OMA结构更紧凑，在水动力条件下不易破碎。在荧光条件下观察到，OMA内裹挟的油滴较多且油滴尺寸大小不一。
细菌与微藻混合作用下形成的OMA絮体尺寸较大，一方面原因可能是细菌和微藻都会生成TEP，TEP的高黏性有助于大尺寸OMA的形成。另一方面，RieBeSle等人[7]认为，高的浮游植物浓度是大型絮状物形成的必要条件。当微藻暴露在阳光下，光合作用产生的多余有机碳会以溶解有机物的形式释放到周围水体中[8]，供细菌生长繁殖并生成更多的TEP，进而形成更大尺寸的OMA。此外，Eenennaam等人[9]发现，当只存在微藻及其与菌混合作用下，都可生成TEP，但后者生成量更多。因此，细菌与微藻共同作用下有助于OMA的形成。
无菌、细菌、大扁藻及菌藻混合作用下OMA的生成速率逐步加快，生成时间由最初的12 h减为3 h，原因可能是细菌与微藻的加入加大了石油与矿物颗粒的碰撞机率，且菌藻分泌的胞外聚合物进一步促进了絮体的聚集。
对OMA形成时间的机理探讨：
油滴与矿物颗粒二者碰撞（损失）可由下式描述[10]：
由于微藻和细菌释放的胞外聚合物的存在，絮凝效率（α）将具有更高的价值[12]。活性基团的存在使TEP表现出胶状特征，为聚集体提供了黏着的基质，有利于OMA的絮凝。
2.2?平均沉降速率
如图5所示，无菌、细菌、青岛大扁藻及菌藻混合條件下生成OMA的沉降速率随时间延长而增大，在第12天取得最大沉降速率，分别为0.70、5.33、6.13和6.17 mm/s，与第1天相比，沉速分别增大29.63%、38.80%、28.51%和26.58%。无菌条件下生成的OMA絮体的沉降速率较小，与其他3种条件相比，OMA沉速相差一个数量级。
OMA形成初期，絮体结构比较松散，沉速较小，在水动力条件下，OMA清除和捕获矿物颗粒，密度变大，沉速加快。OMA的沉降速度可用改进的Stokes方程描述[13]。
其中g是重力加速度;ρa是聚集体的密度;ρw是海水密度;V是聚合体积;CD是阻力系数;A是垂直于沉降方向的聚集体的最大横截面积。阻力系数通常与形状和雷诺数有关，在实验过程中，OMA为自由沉淀，则可考虑其状态为层流沉淀。层流状态对应到图6所示的关系中，所处范围雷诺数Re<1，则此时阻力系数与雷诺数的关系式为：
因此，OMA的沉降速率与其形状和尺寸有关。OMA体积越大，结构密实，沉降速率越大。同时期，无菌条件下生成的OMA尺寸较小，且OMA中油滴尺寸相对较大，OMA密度小，其沉降速率最小。细菌及微藻单独作用下，OMA沉速加快，原因可能是细菌和微藻分泌了一定量的TEP，TEP的高黏性使得OMA黏附了更多的矿物颗粒，同时使絮体更加密实，不易破碎，密度增大，沉降速率加快。细菌和微藻共同作用下形成OMA的沉速最大，但并非二者单独作用下OMA沉速之和，原因可能是细菌与微藻间存在一定的竞争关系，TEP生成量变化不大，即OMA聚合力相差不大。
2.3?TEP含量
如图7所示，细菌、微藻及二者共同作用下经阿尔新蓝染色的TEP数量分别为10个、10个和15个，TEP面积为3.4×108、5.0×108、6.2×108 μm2。
TEP是EPS的部分糖性成分[14]，EPS是由海洋生物分泌，呈凝胶状的有机高分子量天然聚合物[15]，具有一定的黏性，在OMA的形成过程中具有重要作用。
大扁藻在培养至第7天时产生的TEP含量比石油烃降解菌产生的TEP含量高，表明大扁藻在TEP的产生中发挥重要作用。细菌与微藻具有复杂的相互关系。微藻在新陈代谢过程中产生并分泌于水体的有机物质，被细菌摄取后，一部分经细菌代谢后以矿物或其他形式释放回海洋中，又为微藻提供营养及必须的生长因子[16]，因此微藻与细菌共存情况下可能更有利于TEP的生成。TEP与絮体的凝聚有关，TEP含量低，不易形成较大尺寸的OMA，这与菌藻共同作用下TEP生成量高，OMA尺寸更大的实验结果相符。
TEP含量不仅对形成OMA的尺寸有影响，也影响着OMA的沉降速率。细菌与微藻作用下TEP含量高，OMA沉降速率大;细菌作用下TEP含量较低，OMA沉速较小，即TEP含量越高，OMA结构密实，沉降速率越大，而TEP含量低，生成的OMA较松散，沉降性能差。
在海洋中，大量的TEP通过改变凝聚动力学，影响着OMA的动态变化，为海洋环境的生物化学组成（包括细菌、浮游植物、碳以及活性微量元素）提供了重要媒介[17]。
3?结论
与无菌条件下生成的油滴状OMA相比，菌、藻作用下生成的OMA有丝状、纤维状、网状和球状，OMA生成速率加快，最快3 h内即生成OMA。
无菌、细菌、青岛大扁藻及菌藻混合条件下生成OMA的沉降速率随时间延长而增大，在第12天取得最大沉降速率，分别为0.70、5.33、6.13和6.17 mm/s，与第1天相比，沉速分别增大29.63%、38.80%、28.51%和26.58%。
细菌、微藻及二者共同作用下经阿尔新蓝染色的TEP数量分别为10个、10个和15个，TEP面积为3.4×108、5.0×108、6.2×108 μm2。
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