凡纳滨对虾WSSV、IHHNV和CMNV多重PCR检测方法的建立
陈浩楠 刘群 王菁 徐赟霞 王宇 吴艳辉 耿绪云 孙金生 薛淑霞
摘?要：根据偷死野田村病毒（CMNV）的保守基因序列，设计筛选出1对特异性引物CMN279，利用已公布的凡纳滨对虾白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV） 特异性引物WSS235和IHHN356，建立了一种同时检测WSSV、IHHNV和CMNV的多重 PCR 检测方法。收集18种病原、健康对虾组织及WSSV、IHHNV、CMNV阳性病料，开展特异性测试，该方法可以特异性扩增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段，健康对虾肌肉组织、其他18种病原均未扩增出任何片段，特异性强。应用克隆方法制备目的基因质粒，应用连续稀释质粒方法开展灵敏度测试，测定该方法检测灵敏度分别为WSSV 9.74 fg、IHHNV 7.65 fg、CMNV 10 fg;与已报道的多重PCR检测灵敏度相比较，检测灵敏度提高10倍。应用本研究建立的多重PCR检测方法与实验室标准检验方法同时进行22个样品检验，多重PCR检验方法的检验结果与实验室标准方法检验结果符合率为100%。上述实验结果表明：本研究建立的多重PCR检验方法具有特异性强、灵敏度高、检验时间短、检验结果准确度高的特点，可用于WSSV、IHHNV和CMNV三种病原的快速检测诊断。
關键词：多重PCR;白斑综合征病毒;传染性皮下及造血器官坏死病毒;偷死野田村病毒
白斑综合征病毒 （WSSV）和传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）是当前危害全球对虾养殖业的两种主要病原[1]，其引起的对虾疾病被世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health， OIE）《水生动物卫生法典》收录，被列为需要报告的水生动物病毒性疫病。2009年，上述两种疾病被农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》列为水生生物一、二类动物疫病病原[2]，并被农业部列入《水生动物疫病监测计划》，在重要养殖区域进行定时、定点监测。而偷死野田村病毒（CMNV）是导致对虾病毒性偷死病的病原，是近年来新发现的一种病毒，成为危害对虾养殖的又一个重要病原[3]。这三种病毒的存在，严重影响到对虾养殖业的健康发展，每年造成巨大的经济损失。
目前，检测对虾病毒的方法有很多种。其中，组织病理学方法和电镜技术存在耗时费力、操作繁琐的问题，实用性较差。而免疫学方法存在抗体不易获得和成本过高的问题，很难在生产中进行推广应用。随着分子生物技术的发展而出现的常规PCR检测技术，因其具有特异性强、反应迅速、灵敏度高的特点，而被广泛应用于对虾病毒检测。但是，常规PCR和RT-PCR也具有局限性，一次PCR反应只能检测一种病原。多重PCR技术的诞生刚好弥补了上述缺点，其突出特点是一次PCR反应可同时检测多种病原，在对虾病原检测中具有很高的实用价值[4]。
本研究在前人的研究基础上，以北方对虾养殖过程中的常见病毒为研究对象，依据现有序列，建立WSSV、IHHNV、CMNV 多重PCR检测技术。在常规病原检测中使用该方法，可以一次检测WSSV、IHHNV、CMNV 三种病原的携带情况，大大降低工作量，节约检测时间和检测成本，在对虾健康养殖和产业发展的生物安全监控中具有重要意义[5]。
1?材料与方法
1.1?实验材料
试验所需的携带WSSV、IHHNV和CMNV阳性样品材料由天津市水生动物疫病预防控制中心实验室提供，样品编号分别为ZX2015-JY62、ZX2015-JY1656和ZX2015-JY1636。
TOP10感受态细胞（CB104）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN， DP209-03）、TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒（TIANGEN， DP103）、TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒均购于天根生化科技（北京）有限公司。
pMD18-T Vector （TaKaRa， D101A）购于宝生物工程（大连）有限公司。
1.2?主要试剂
Ex Taq DNA 聚合酶，10×Ex Taq Buffer （Mg2+ free），MgCl2 （25 mmol/L），dNTP mixture （10 mmol/L），DL2000 DNA Marker，均购于宝生物工程（大连）有限公司。RNase-Free H2O，TRIzol Reagent，购于北京索莱宝科技有限公司。PCR引物由金唯智生物科技有限公司（北京）合成。LB培养基购于北京陆桥有限公司。
1.3?试验方法1.3.1?引物设计与合成?依据NCBI提供的偷死野田村病毒（CMNV）序列（Gene Bank NO.： KM112247），利用Primer Premier 5软件，设计筛选特异性引物CMN279。选取我单位设计的引物序列WSS235（CN 1944666A）为对虾白斑综合征病毒特异性引物。查阅OIE水生动物疾病诊断手册，选择IHHN356为传染性皮下及造血器官坏死病毒特异性引物。引物由金唯智生物科技有限公司（北京）合成，引物序列见表1。
1.3.2?核酸提取及cDNA合成?取100 mg鳃丝、肝胰腺，放入1.5 mL离心管中，用小剪刀剪碎。样品的DNA模板按照TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取，将提取后的模板-20 ℃保存备用。样品的RNA模板按照TRIzol Reagent说明书进行提取，利用随机引物，将提取的RNA反转录为cDNA，并保存于-80 ℃备用。
1.3.3?单重PCR扩增及质粒构建?参照Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa， RR01AM）说明书，配置25 μL PCR反应体系：10× Ex Taq Buffer （Mg2+ free） 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 1.5 μL，dNTPs （10 mmol/L） 2 μL，F （20 μmol/L） 0.5 μL，R （20 μmol/L） 0.5 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.125 μL，RNase-Free H2O 16.875 μL，模板1 μL。PCR程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性20 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸25 s，40个循环，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保温。进行PCR扩增后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，并观察结果。将PCR产物送往金唯智生物科技有限公司（北京）进行测序。
利用连接、转化、克隆等技术手段，获得浓度和纯度较高的含有目的基因片段的重组质粒。用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒（TIANGEN， DP103）进行质粒提取，并使用超微量核酸测定仪（IMPLEN， P330）测定其浓度及纯度，于-80 ℃保存备用。
1.3.4?多重PCR检测方法的建立和优化?以Ex Taq DNA聚合酶提供的体系为基础，建立多重PCR反应体系和PCR反应程序。以建立的多重PCR反应体系和PCR反应程序为基础，依次进行Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Ex Taq DNA聚合酶浓度和退火温度的优化。
设计Mg2+在体系中的终浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L等六个浓度梯度，进行体系中Mg2+浓度的优化。
设计dNTPs在体系中的终浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L等六个浓度梯度，进行体系中dNTPs浓度的优化。
設计引物在体系中的终浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 μmol/L等六个浓度梯度，进行体系中引物浓度的优化。
设计Ex Taq DNA聚合酶在体系中的终浓度为0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 U/μL等六个梯度，进行体系中Ex Taq DNA聚合酶浓度的优化。
以单重PCR反应程序为基础进行反应程序的优化，退火温度共设置6个梯度，分别为49.5、52.5、55.5、58.5、61.5和64.5 ℃。
1.3.5?多重PCR反应的特异性测试
以凡纳滨对虾基因组为模板，引物分别为对虾18S rDNA引物和多重PCR反应引物，利用优化后的体系和程序，进行基因组特异性测试。
利用目前实验室掌握的病原（寄生虫、细菌、病毒），进行该方法的特异性测试。病原主要包括：病毒性神经坏死病病毒（Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV）、大鲵虹彩病毒（Andrias davidianus iridovirus，ADIV）、中华鳖虹彩病毒（Soft shelled turtle iridovirus，STIV）、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus-873，GCRV-873）、鲤春病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）、传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus ， IHNV）、锦鲤疱疹病毒（Koi hepesvirus，KHV）、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus-9014，GCRV-9014）、坏鳃指环虫（Dactylogyrus vastator）、鳙指环虫（Dactylogyrus aristichthy）、小鞘指环虫（Dactylogyrus vaginulatus）、页形指环虫（Dactylogyrus lamellatus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio paraheamolyticus）、肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）、副溶血弧菌高致病性基因（PirA、PirB）等。
1.3.6?多重PCR反应的灵敏性测试?以10倍比梯度稀释的质粒（E+0～E+10）作为模板，利用优化后的体系和程序，进行灵敏性测试。测试过程中，以电泳条带明晰可辨为检测临界线，从而测试该方法的灵敏性。
1.3.7?多重PCR反应的准确性测试?随机抽取2015年实验室检验样品22个，同时进行多重PCR检测和标准方法检测，以标准方法PCR检测结果为准，对多重PCR检测结果进行比较，从而评价多重PCR检测方法的准确性。标准方法见表2。
2?结果
2.1?单重PCR扩增结果
采用合成的引物WSS235、IHHN356和CMN279，分别对相应的病毒进行扩增，将PCR产物送往金唯智生物科技有限公司（北京）进行测序。结果显示，三对引物均能扩增出相应病毒的单一目的条带（图1），测序后经比对发现，扩增序列为相应病毒的特异性目的基因。
2.2?多重PCR检测方法的确定
通过对Mg2+浓度（图2）、dNTPs浓度（图3）、引物浓度（图4）和Ex Taq DNA聚合酶浓度（图5）进行优化，得出多重PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer （Mg2+ free） 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 2.0 μL，dNTPs （10 mmol/L） 2.5 μL，WSSV、IHHNV和CMNV上下游引物 （20 μmol/L） 分别1.25 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 1.0 μL，RNase Free H2 O 6.5 μL，模板3.0 μL。
通过对退火温度（图6）进行优化，得到PCR反应程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性20 s，61.5 ℃复性30 s，72 ℃延伸25 s，40个循环，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保温。
2.3?多重PCR反应的特异性
以凡纳滨对虾基因组为模板，引物分别为对虾18S rDNA引物和多重PCR反应引物，利用优化后的体系和程序，进行基因组特异性测试，结果见图7。扩增结果显示，当模板为对虾基因组时，进行多重PCR反应，无扩增条带出现，说明建立的多重PCR反应不能扩增凡纳滨对虾基因组。
以20种病原的DNA或cDNA为模板进行多重PCR反应，结果见图7。电泳图显示，阳性对照在235 bp、279 bp、356 bp处出现扩增条带，且条带清晰，无拖尾，也未发现由于引物二聚体或引物错配而出现的非特异性扩增条带;同时，其他非目标病原DNA或cDNA均无扩增条带出现。由此说明该方法特异性强，引物之间无干扰。
2.4?多重PCR反应的灵敏性
多重PCR反应的灵敏性测试结果如图8所示，当稀释度为105copies/μL即模板中WSSV含量为0.974 pg、CMNV含量为1 pg、IHHNV含量为0.765 pg时，扩增效率明显减弱，目的条带变暗;当稀释度到103copies/μL及模板中WSSV含量为9.74 fg、CMNV含量为10 fg、IHHNV含量为7.65 fg时，能够清晰看到电泳条带;当稀释度到102copies/μL及模板中WSSV含量为0.974 fg、CMNV含量为1 fg、IHHNV含量为0.765 fg时，目的片段模糊。因此，本实验建立的多重PCR的检出限为103copies/μL，即模板中WSSV含量为9.74 fg、CMNV含量为10 fg、IHHNV含量为7.65 fg。
2.5?多重PCR反应的准确性测试
抽取实验室保存的检验样品22个，同时进行标准方法检测和多重PCR检测，以标准方法PCR检测结果为准，对多重PCR检测结果进行比较，从而评价多重PCR方法的准确性。对比结果统计见表3。
注：B： 空白对照;M： DL 2000Marker;+： 阳性对照;1泳道： 1010copies/μL ;2泳道： 109copies/μL;3泳道： 108copies/μL ;4泳道： 107copies/μL;5泳道： 106copies/μL ;6泳道： 105copies/μL ;7泳道： 104copies/μL ;8泳道： 103copies/μL;9泳道： 102copies/μL ;10泳道： 101copies/μL;11泳道： 100copies/μL图8?灵敏度测试结果
应用建立的多重PCR方法进行对虾样品检验，检测单一病毒的准确率为100%，检测混合病毒的准确率为100%，表明该方法准确可靠。
3?讨论
多重PCR（multiplex PCR，又称多重引物PCR或复合PCR），是在常规PCR基础上发展起来的一种DNA扩增技术，其反应原理、试剂、操作、仪器设备等与常规PCR反应相同，其突出特点是一次 PCR 反应即可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床诊断病毒的混合感染中具有很高的实用价值[4]。该理论最早被Chamberian提出[6]，到2002年该技术被用于检测凡纳滨对虾同时携带WSSV、TSV的情况[7]，随后该方法在临床检验中发挥重要作用。
随着虾类病毒混合感染的情况越来越严重，在进行虾病诊断和亲虾筛选过程中，常规PCR和RT-PCR技術虽然较传统检验方法缩短了检验时间，提高了准确性，但是仍然要消耗大量的检测试剂、需要足够多的仪器设备以及完成大量的重复工作，这些问题给实验室造成了巨大的压力[5]。本研究建立的多重PCR检测方法，只需一次PCR反应，就能检测3种病毒，节约了2/3的检测成本。另外，该方法可以在8 h内同时完成凡纳滨对虾携带WSSV、IHHNV和CMNV的快速检测，较常规PCR方法节省时间5 d，大大提高了检测效率，缩短了检测周期，能够满足临床快速检测的要求，可用于凡纳滨对虾病毒混合感染的临床检测和亲虾筛选等工作。
本研究通过Primer Premier 5软件进行引物设计，并严格遵守引物设计原则，最终获得多对特异性引物;结合现有PCR条件，筛选出符合要求的特异性引物。通过上述方法获得的引物序列，具有扩增片段短、扩增效率高、特异性强等特点。这是多重PCR检测方法灵敏度高的一个重要原因，而另一个原因是DNA聚合酶的改变。Ex Taq DNA 聚合酶与r Taq DNA 聚合酶相比，具有扩增效率更高、错配率更低的特点。因此，本研究选择扩增效果更好的Ex Taq DNA 聚合酶作为多重PCR反应的催化剂，能够更好的完成多重PCR反应，保证PCR结果的准确性，从而提高了多重PCR检测方法的灵敏度。
在我国，杨冰等首次研究了养殖对虾同时携带WSSV、IHHNV的情况，并利用多重PCR技术检出两种病毒，该体系对WSSV DNA的检测灵敏度为2.6 pg，对IHHNV DNA检测灵敏度为99.25 fg[8]。吴思思等用多重PCR同时检测WSSV和TSV，其灵敏度分别为5 pg和0.5 pg。此后，很对学者开展了利用多重PCR技术检测虾类病原的研究，其灵敏度一般在0.1～10 pg范围内。而本研究建立的多重PCR检测方法，能够最低检测出WSSV 9.74 fg、CMNV 10 fg、IHHNV 7.65 fg，比其他多重PCR反应灵敏度提高10倍。
利用多重PCR检测方法与实验室现有检测方法分别对实验室样品进行检测，发现两种方法的检测结果完全一致，说明该方法的准确性高。因此，本研究建立的多重PCR检测方法，具有检验时间短、特异性强、灵敏度高、结果准确的特点。
WSSV、IHHNV和CMNV作为目前对虾养殖生产中重要的病毒病原，不仅能够单独感染养殖对虾，还能够混合感染。在对上一年度检验结果进行统计时，发现混合感染样品占样品总数的10%，这说明多种病毒混合感染的现象日趋严重。本研究建立的多重PCR检测方法具有快速、准确的特点，满足生产的需要。在亲虾筛选、苗种检疫中应用，能保证养殖者投放的虾苗安全、可靠;在养殖过程中定期检测病原携带情况，可以及早发现疾病，防止疾病的爆发流行，最大限度地减少经济损失，保证对虾健康养殖和产业发展。
参考文献：
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[8] 杨冰.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的检测及其流行情况初步调查[D].青岛：中国海洋大学，2004.
（收稿日期：2018-10-15）
