红原牦牛乳制品中苯甲酸溯源分析
章唯++李江
当前，牦牛乳的加工环境，由于经济落后的原因，主要是以自给自足的方式进行生产一直处于初级阶段。手工采集、清洗的不达标、较差的卫生环境、质量的不稳定、加上工业化程度的不足，使牦牛乳一直没有登上乳制品的主流销售渠道。牦牛作为高原地区的特殊群种，其特殊的经济效益是值得我们研究的。
红原牦牛乳业有限公司是专注于牦牛奶粉的一家企业，但是由于其苯甲酸的含量过高，一直被受限于局部地区的销售。本次研究的主要目的是为了追溯其苯甲酸的来源，建立了乳产品中苯甲酸超标控制方案，使其产生更加广阔的经济效益。
高效液相色谱法检测苯甲酸马尿酸
试剂与仪器。（1）主要仪器与试剂
高效液相色谱仪（AgiLent-1220）；色谱柱（迪马公司C18柱，250×2.6mm）；超声波清洗器（Multiwave PRO公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Chemicl公司）； 0.4%乙酸（抽滤）；乙酸锌（183 g/L）；亚铁氰化钾（92 g/L）；苯甲酸、马尿酸混合标准液（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，上海源葉生物科技有限公司）（2）样品红原牦牛乳奶粉；红原牦牛发酵乳；红原源头奶（经过8小时运输24小时4℃冰箱储存）。
样品均由红原牦牛乳业有限责任公司提供。
实验方法。
（1）HPLC参考条件
色谱柱：C18柱，250×2.6mm，粒径5μm
流动性：甲醇+0.4%乙酸溶液（抽滤）=50+50
流速：1mL/min
柱温：35℃
检测波长：235nm
进样量：20μL
进样时间：15min
（2）苯甲酸马尿酸标准曲线建立
出峰时间：马尿酸于7.9分钟出峰，苯甲酸于10.7分钟出峰。两者出峰时间不同，马尿酸、苯甲酸得到了很好的分离。
建立线性方程：
马尿酸：Y= 68.17743X - 20.70608，R2= 0.99961
苯甲酸：Y= 108.65547X - 4.57035，R2= 0.99920
（3）样品预处理
准确称量约2g试样于50mL离心管中，加入超纯水25mL并混匀，于50℃水浴超声20min。冷却后，加入亚铁氰化钾溶液4mL与乙酸锌溶液4mL，震荡混匀，于5000r/min离心机，离心20min。将离心后样品中的水相转移至50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度。经过0.45μm的滤膜，样品瓶分装后，用高效液相色谱测定。
数据与分析。
对进行预处理的样品用HPLC进行，再根据GB5009.28-2016中的公式，可以得试样中苯甲酸、马尿酸的含量。通过测量可以得出红原牦牛乳中马尿酸含量为17.627mg/kg，苯甲酸的含量为17.139mg/kg；发酵乳中马尿酸的含量为0mg/kg，苯甲酸的含量为29.656mg/kg；奶粉中马尿酸的含量为85.259mg/kg，苯甲酸的含量为118.986mg/kg。
由此可以发现，本来存在于牛乳中的马尿酸，到了发酵乳中就消失了。而发酵乳中的苯甲酸含量也上升了。根据此趋势，实验可得马尿酸的确转化为了苯甲酸。而乳粉，也因为加工工艺中的冷冻浓缩，苯甲酸产生了富集而有着较高的含量。因此控制原料乳中的苯甲酸便可以控制红原乳制品中苯甲酸的含量。
回收率实验。取牛奶样品，做空白对照组。样品按预处理后，分别取苯甲酸马尿酸5μg/ml，10μg/ml2个水平2个平行做回收率实验，并用高效液相色谱进行测定。
本文采用苯甲酸、马尿酸的混合标准溶液加标5μg/ml，10μg/ml回收率分别为：94.64%，89.57%，82.55%，94.89%。马尿酸、苯甲酸平均回收率为88.60%和92.23%，大于80%，可得该方法有着较高的可行度。
结果与分析
红原牦牛乳目前存在问题。
（1）采集环境：牦牛乳目前的都是采用传统的牧民手工采集然后奶站收购的方式，既没有机械的工业化，也没有奶牛的乳头药浴技术。不规范的采集方式与恶劣的采集环境，对牦牛乳中微生物的数目有着较大影响。而微生物的数目也直接影响了马尿酸的转化。
（2）温度：高原的昼夜有着较大的温差，中午的高温会导致微生物的迭代生长。
（3）储存环境：牧民将采集了的牦牛乳，并不会直接送向移动收奶站，待储存一定时间后才会进行回收。期间的不规范储存也会导致微生物的生长。
红原牦牛乳中苯甲酸的控制措施。控制苯甲酸的含量，我对此提出了2点控制措施：一方面是采集的规范化：环境卫生的控制、规范的挤奶操作、牦牛乳原料乳储存与运输的质量控制等方法都对控制牦牛原料乳中的质量都有着明显的效果。优良的环境可以减少微生物的菌落总数，对苯甲酸的含量进行了一定程度上的控制。一方面是保存的质量提高：牧民可以利用高温杀菌；加入41. 47mmol/L 浓度二氧化碳的碳酸水；低温的保存环境；添加30～50IU/ mL的Nisin等方法，提高牦牛乳在牧民中的保存质量，之后再将牛乳运输至移动奶站进行系统的工业加工，得到较高质量的牦牛乳。
当前，牦牛乳的加工环境，由于经济落后的原因，主要是以自给自足的方式进行生产一直处于初级阶段。手工采集、清洗的不达标、较差的卫生环境、质量的不稳定、加上工业化程度的不足，使牦牛乳一直没有登上乳制品的主流销售渠道。牦牛作为高原地区的特殊群种，其特殊的经济效益是值得我们研究的。
红原牦牛乳业有限公司是专注于牦牛奶粉的一家企业，但是由于其苯甲酸的含量过高，一直被受限于局部地区的销售。本次研究的主要目的是为了追溯其苯甲酸的来源，建立了乳产品中苯甲酸超标控制方案，使其产生更加广阔的经济效益。
高效液相色谱法检测苯甲酸马尿酸
试剂与仪器。（1）主要仪器与试剂
高效液相色谱仪（AgiLent-1220）；色谱柱（迪马公司C18柱，250×2.6mm）；超声波清洗器（Multiwave PRO公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Chemicl公司）； 0.4%乙酸（抽滤）；乙酸锌（183 g/L）；亚铁氰化钾（92 g/L）；苯甲酸、马尿酸混合标准液（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，上海源葉生物科技有限公司）（2）样品红原牦牛乳奶粉；红原牦牛发酵乳；红原源头奶（经过8小时运输24小时4℃冰箱储存）。
样品均由红原牦牛乳业有限责任公司提供。
实验方法。
（1）HPLC参考条件
色谱柱：C18柱，250×2.6mm，粒径5μm
流动性：甲醇+0.4%乙酸溶液（抽滤）=50+50
流速：1mL/min
柱温：35℃
检测波长：235nm
进样量：20μL
进样时间：15min
（2）苯甲酸马尿酸标准曲线建立
出峰时间：马尿酸于7.9分钟出峰，苯甲酸于10.7分钟出峰。两者出峰时间不同，马尿酸、苯甲酸得到了很好的分离。
建立线性方程：
马尿酸：Y= 68.17743X - 20.70608，R2= 0.99961
苯甲酸：Y= 108.65547X - 4.57035，R2= 0.99920
（3）样品预处理
准确称量约2g试样于50mL离心管中，加入超纯水25mL并混匀，于50℃水浴超声20min。冷却后，加入亚铁氰化钾溶液4mL与乙酸锌溶液4mL，震荡混匀，于5000r/min离心机，离心20min。将离心后样品中的水相转移至50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度。经过0.45μm的滤膜，样品瓶分装后，用高效液相色谱测定。
数据与分析。
对进行预处理的样品用HPLC进行，再根据GB5009.28-2016中的公式，可以得试样中苯甲酸、马尿酸的含量。通过测量可以得出红原牦牛乳中马尿酸含量为17.627mg/kg，苯甲酸的含量为17.139mg/kg；发酵乳中马尿酸的含量为0mg/kg，苯甲酸的含量为29.656mg/kg；奶粉中马尿酸的含量为85.259mg/kg，苯甲酸的含量为118.986mg/kg。
由此可以发现，本来存在于牛乳中的马尿酸，到了发酵乳中就消失了。而发酵乳中的苯甲酸含量也上升了。根据此趋势，实验可得马尿酸的确转化为了苯甲酸。而乳粉，也因为加工工艺中的冷冻浓缩，苯甲酸产生了富集而有着较高的含量。因此控制原料乳中的苯甲酸便可以控制红原乳制品中苯甲酸的含量。
回收率实验。取牛奶样品，做空白对照组。样品按预处理后，分别取苯甲酸马尿酸5μg/ml，10μg/ml2个水平2个平行做回收率实验，并用高效液相色谱进行测定。
本文采用苯甲酸、马尿酸的混合标准溶液加标5μg/ml，10μg/ml回收率分别为：94.64%，89.57%，82.55%，94.89%。马尿酸、苯甲酸平均回收率为88.60%和92.23%，大于80%，可得该方法有着较高的可行度。
结果与分析
红原牦牛乳目前存在问题。
（1）采集环境：牦牛乳目前的都是采用传统的牧民手工采集然后奶站收购的方式，既没有机械的工业化，也没有奶牛的乳头药浴技术。不规范的采集方式与恶劣的采集环境，对牦牛乳中微生物的数目有着较大影响。而微生物的数目也直接影响了马尿酸的转化。
（2）温度：高原的昼夜有着较大的温差，中午的高温会导致微生物的迭代生长。
（3）储存环境：牧民将采集了的牦牛乳，并不会直接送向移动收奶站，待储存一定时间后才会进行回收。期间的不规范储存也会导致微生物的生长。
红原牦牛乳中苯甲酸的控制措施。控制苯甲酸的含量，我对此提出了2点控制措施：一方面是采集的规范化：环境卫生的控制、规范的挤奶操作、牦牛乳原料乳储存与运输的质量控制等方法都对控制牦牛原料乳中的质量都有着明显的效果。优良的环境可以减少微生物的菌落总数，对苯甲酸的含量进行了一定程度上的控制。一方面是保存的质量提高：牧民可以利用高温杀菌；加入41. 47mmol/L 浓度二氧化碳的碳酸水；低温的保存环境；添加30～50IU/ mL的Nisin等方法，提高牦牛乳在牧民中的保存质量，之后再将牛乳运输至移动奶站进行系统的工业加工，得到较高质量的牦牛乳。
