急性氨氮胁迫对红螯螯虾血细胞凋亡的影响

    潘训彬+张秀霞+冼健安

    摘 要：氨氮是水产养殖过程中的常见毒性污染物之一，为探讨氨氮对红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）血细胞的细胞毒性机制，研究了氨氮胁迫作用下红螯螯虾血细胞凋亡状态的变化。以17.6 mg/L氨氮对红螯螯虾幼虾进行急性胁迫，于胁迫后的0、48、72和96 h取血淋巴，应用流式细胞术测定血细胞总数（THC）、胞内游离Ca2+含量、线粒体膜电位（MMP）和血细胞凋亡率。结果显示，红螯螯虾的THC在胁迫的72 h开始有显著的下降，在96 h时达到最低值；血细胞胞内游离Ca2+含量在48 h开始有显著的升高，在96 h达到最高值；血细胞MMP在72 h开始有显著的下降，在96 h达到最低值；血细胞凋亡率在72 h开始有显著的升高，在96 h时达到最高值，为9.39%。这些结果表明，胞内游离Ca2+含量是对氨氮胁迫最为敏感的指标；氨氮急性胁迫诱导红螯螯虾血细胞发生了Ca2+参与调节、线粒体通路相关的细胞凋亡，从而导致了THC的下降。

    关键词：氨氮；红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）；血细胞；凋亡；流式细胞术

    中图分类号：X503.225文献标识码：A

    水产养殖过程中，水体氨氮主要来源于水产动物的氮代谢排泄物以及粪便和残饵的氨化作用[1]。众多研究表明，氨氮对水产动物具有较强的毒性[2-4]。随着养殖时间的延长，氨氮容易不断地积累于水环境中，从而对养殖水产动物产生胁迫毒害作用。目前，氨氮对红螯螯虾毒性影响的研究仍甚少，主要集中在半致死浓度以及氨氮对生理生化的影响上[5-6]。虾类等甲壳动物依赖先天性免疫进行免疫防御，其中血细胞在细胞免疫和体液免疫过程中具发挥十分重要的作用。本研究应用流式细胞术研究氨氮对红螯螯虾血细胞凋亡的影响，探讨氨氮对红螯螯虾血细胞的细胞毒性以及氨氮的免疫抑制作用机制，以期为进一步研究如何提高红螯螯虾的抗氨氮胁迫能力提供理论基础。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）购自海南省琼海市某养殖场，平均体重为（15.16±2.69）g，在实验室环境条件下进行驯养，水体环境条件为：pH 7.9～8.0，温度24±2℃，一直保持曝气。驯养一周后，选取健康无病患、附肢完整、处于蜕皮间期且反应灵敏的螯虾进行实验。

    1.2 氨氮胁迫

    本研究组之前的试验结果显示，氨氮对红螯螯虾幼虾的安全浓度为8.8 mg/L，根据这一结果以及实际养殖水体情况，本试验设定的氨氮胁迫浓度为17.6 mg/L，以NH4Cl作为氨氮的来源进行配制，不添加组作为对照组。试验在塑料储物箱中进行，每箱放置30 L水和幼虾12尾，每组设置3个平行。试验期间不投喂，保持曝气。为保证水体的氨氮浓度稳定，预先配制17.6 mg/L氨氮的水，每24 h换水一次。于试验的0，48，72和96 h取样测定。

    1.3 血细胞悬液的制备

    用2.5 mL一次性注射器吸取400 μl预冷的抗凝剂（葡萄糖20.5 g/L，柠檬酸钠8 g/L，氯化钠4.2 g/L，pH 7.5），然后从虾的围心腔抽取等量的血淋巴。取稀释血淋巴200 μL，直接用于血细胞总数（THC）的测定，余下的稀释血淋巴用预冷的抗凝剂进一步稀释，调整细胞浓度约为1×106个/mL，制得血细胞悬液，用于其它流式细胞术指标的测定。每尾虾的血淋巴作为一个单独样品进行检测。

    1.4 血细胞总数（Total haemocyte count，THC）

    商品试剂SYBR GreenI（Sigma）的DMSO（二甲基亚砜）溶液的浓度为10 000×，以DMSO稀释为1 000×的工作液。分别取稀释血淋巴200 μL，加入2 μL SYBR GreenI工作液，使终浓度为10×，室温避光孵育60 min，经 200目筛网过滤后上流式细胞仪（BD，FACSCalibur）检测，每个样品上样1 min。以第一荧光通道（FL1）获取SYBR GreenI的绿色荧光强度，根据荧光强度大小划分细胞碎片区域与完整细胞区域（完整细胞因包含完整的核酸，结合SYBR GreenI后发出强的绿色荧光，非细胞颗粒或细胞碎片没有核酸或核酸量少，SYBR GreenI结合量少，因而荧光强度弱），分析并记录完整细胞的个数，每个样品读取3次。根据公式计算THC[7]。

    1.5 胞内游离Ca2+含量

    分别取血细胞悬液200 μL，加入终浓度为10 μmol/L的Fluo-3/AM（Sigma），室温避光孵育60 min，经 200目篩网过滤后上流式细胞仪检测。以FL1获取Fluo-3的绿色荧光强度，以FL1为横坐标，细胞数量为纵坐标作单参数直方图，细胞的Fluo-3平均荧光强度与胞内游离Ca2+含量成正比。

    1.6 线粒体膜电位（MMP）

    分别取血细胞悬液200 μL，加入终浓度为2 mmol/L的DIOC6（Sigma），室温避光孵育10 min，经 200目筛网过滤后上流式细胞仪检测。以FL1获取DIOC6的绿色荧光强度，以FL1为横坐标，细胞数量为纵坐标作单参数直方图，每个样品的细胞获取数为10 000个，细胞的DIOC6平均荧光强度与MMP成正比。

    1.7 血细胞凋亡率

    以Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（Invitrogen）测定血细胞凋亡率。实验操作按照试剂盒说明书的步骤稍作调整来进行。取血细胞悬液600 μL，以800g，4℃离心10min，弃上清后，细胞沉淀重悬于1 x Annexin V结合缓冲液中，使细胞浓度约为3 × 106 个/mL，每100 μL血细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液，避光染色15 min后加入400 μL 1 x Annexin V结合缓冲液，200目筛网过滤后立即上流式细胞仪检测。以FL1获取FITC的绿色荧光强度，以FL2获取PI的橙红色荧光强度，以FL1为横坐标、FL2为纵坐标作双参数散点图，用十字门划分各类细胞的区域（右下象限为前期凋亡细胞，右上象限为后期凋亡和死亡细胞，凋亡率为右下象限和右上象限的细胞所占的比例），每个样品的细胞获取数为10 000个，分析凋亡细胞所占的比例。

    1.8 统计分析

    结果显示为平均值 ± 标准差（Mean ± SD），实验数据利用SPSS 18.0进行t检验分析，P<0.05确认为差异性显著。

    2 结果

    2.1 血细胞总数

    如图1所示，对照组螯虾的THC为7.91×106～8.72×106个/mL。氨氮胁迫48 h时，螯虾THC没有显著变化（P>0.05）；胁迫72 h时，与对照组相比，胁迫组螯虾的THC开始显著下降（P<0.05），在96 h时达到最低值，为3.46×106个/mL；在胁迫120 h时，THC有所恢复，但仍显著低于对照组（P<0.05）。

    2.2 胞内游离Ca2+含量

    如图2所示，与对照组相比，胁迫组螯虾血细胞胞内游离Ca2+含量在48 h开始有显著的上升（P<0.05）；在96 h时达到了最高值，为对照组的2.82倍；在120 h有一定的下降，但仍显著高于对照组（P<0.05）。

    2.3 线粒体膜电位

    如图3所示，与对照组相比，胁迫组螯虾血细胞MMP在72 h开始有显著的下降（P<0.05）；在96 h时达到最低值，为对照组的48.9%；在120 h有一定的恢复，但仍显著低于对照组（P<0.05）。

    2.4 血细胞凋亡率

    如图4所示，对照组螯虾的血细胞凋亡率为2.46%～2.86%。与对照组相比，胁迫组螯虾的血细胞凋亡率在72 h时开始有显著的提高（P<0.05）；在96 h达到最高值，为9.39%；在120 h下降为7.01%，但仍显著高于对照组（P<0.05）。

    3 讨论

    血细胞在虾类等甲壳动物的免疫过程中发挥着重要的作用，因此THC常作为体现虾类免疫状态的重要指标。各种环境因子的胁迫作用均会导致虾类THC的显著下降，从而对虾类的免疫功能产生了抑制作用[8-9]。还有研究认为，THC下降到一定的阈值时会导致虾类的死亡[10]。因此，环境胁迫对THC的影响不容忽视。本研究前期的研究结果显示，红螯螯虾的氨氮耐受能力较强，其幼虾的氨氮安全浓度为8.8 mg/L，为使胁迫作用明显，本试验设置了2倍的安全浓度作为胁迫浓度。以往的研究显示，氨氮胁迫会导致凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[11]、日本对虾（Penaeus japonicus）[12]、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）[13]、日本沼虾（M.nipponense）[14]、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）[15]等虾类的THC的下降。本研究结果也显示，氨氮胁迫导致了红螯螯虾THC的显著下降。也有研究得出了相反的结论，其研究结果显示氨氮胁迫对罗氏沼虾的THC没有显著影响[16]，但比较可发现，这一相反结果可能与该研究所设置的氨氮浓度以及取样时间有关。该研究设置的氨氮浓度较低，为0.55～3.18 mg/L，可能对血细胞没有产生显著的细胞毒性作用；该研究的取样时间点仅为胁迫的第7天，取样时间点太少，可能导致错过了显著影响的时期，本研究结果显示，在胁迫48 h时THC没有显著变化，72 h时THC才开始显著下降，96 h时达到了最低值，而120 h时有一定的恢复，这些结果表明氨氮对THC的影响与胁迫时间有密切的关系。

    亚硝酸盐、重金属等胁迫作用的研究报道显示，血细胞数量的减少与血细胞被诱导发生凋亡有关[8-9]。高浓度氨氮胁迫会诱导中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）血细胞中凋亡蛋白Caspase的表达量的显著升高[17]。本研究结果显示，氨氮胁迫72 h开始，红螯螯虾血细胞凋亡率有显著的升高，在120 h时，凋亡率有所下降，这些结果与THC的结果吻合，表明氨氮胁迫诱导了血细胞的凋亡，从而导致THC的下降。胞内游离Ca2+含量的升高以及MMP的下降是细胞凋亡的两个典型事件。在细胞凋亡的前期，内质网等Ca2+库受到损伤，其储存的Ca2+被大量释放到细胞质中，造成胞质内的游离Ca2+含量的迅速升高，游离Ca2+含量会进一步促进其它凋亡事情的发生[18]。本研究结果显示，氨氮胁迫48 h开始，血细胞胞内游离Ca2+含量已出现显著的升高，此时THC、凋亡率和MMP仍未发生显著的变化，表明胞內游离Ca2+含量是对氨氮胁迫最为敏感的指标，同时也表明氨氮所诱导的血细胞凋亡是一个Ca2+参与调节的凋亡过程。由于质子泵存在于线粒体内膜，可将线粒体基质中的质子泵入膜间隙，线粒体内膜两侧形成的跨膜电位则MMP。正常的MMP是线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP所必需的。细胞凋亡过程中，线粒体膜的通透性发生改变，造成了MMP的下降，一些凋亡因子被释放到胞质中，诱导其它凋亡事件的进一步发生[19]。本研究结果显示，氨氮胁迫可造成红螯螯虾血细胞MMP的显著下降，这一结果与凋亡率的结果吻合，表明氨氮所诱导的血细胞凋亡是线粒体通路相关的细胞凋亡。

    本试验结果表明，氨氮胁迫作用对红螯螯虾血细胞产生了毒害作用，氨氮诱导血细胞发生了Ca2+参与调节、线粒体通路相关的凋亡，从而导致THC的下降。THC的下降可能引起螯虾免疫力的下降，使螯虾更容易受到病原体的感染，因此在养殖过程中应注意加强对水体氨氮含量的控制，在氨氮积累较为严重的养殖后期，更应注意预防疾病的爆发。

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