低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏的酶活性、组织结构及免疫基因表达的影响

    孙梦蕾　姜志强　蒋洁兰　王莉苹

    摘 要：为探讨低盐胁迫下肝脏在红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）机体免疫中的作用，在肝脏酶活性、组织结构和基因表达水平3个方面进行了研究。结果表明，低盐（盐度4‰）胁迫下红鳍东方鲀肝脏中总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）的酶活性显著高于对照组（P<005）；肝脏组织结构中肝细胞发生肿大，形状变形；肝脏IL15和TLR3基因的表达量显著升高（P<0.05），而IRF2基因的表达量却未有显著性差异（P>0.05）。

    关键词：红鳍东方鲀；肝脏；酶活性；组织结构；基因表达

    红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）属鲀形目（Tetraodontiformers）、鲀亚目（Tetraodontoidei）、鲀科（Tetraodontidae）、东方鲀属（Takifugu），属于广盐性底栖鱼类，适盐范围为5‰～45‰，最适盐度为15‰～35‰[1-2]，生活于近海底层区域，因其肉质鲜嫩、味道独特、营养价值高，因而成为人们广泛喜爱的美食之一。因红鳍东方鲀对盐度的适应性较强，所以红鳍东方鲀成为众多学者研究盐度变化对鱼类影响的重要材料。

    盐度是鱼类生存、生长的重要影响因子之一，尤其对广盐性鱼类来说，所生存的水环境的盐度变化会引起鱼类体内酶活性、组织结构和基因表达量的适应性改变[3-4]，研究低盐条件下鱼类机体的生理响应，可帮助了解鱼类的抗低盐机制，指导鱼类的健康养殖。本论文通过对红鳍东方鲀在盐度变化过程中肝脏酶活性、组织结构及相关免疫基因的研究，探讨肝脏在红鳍东方鲀机体免疫中的作用，可为红鳍东方鲀对盐度变化的适应性研究提供理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料与实验设计

    所用红鳍东方鲀幼鱼均购自大连天正实业有限公司，于大连海洋大学北方海水增养殖重点实验室暂养7 d后，从中选取平均体长为（7.18±034）cm，平均体重为（11.34±2.13）g的健康个体于容积为200 L的方形水槽中进行实验，24 h连续充气。实验用水为净化处理的天然海水（盐度32‰）和与曝气后自来水配制成的低盐度海水。

    盐度设为32‰（对照组）和4‰（低盐度组），每个盐度设三个平行。每个盐度每个水槽中随机放入10尾红鳍东方鲀幼鱼，养殖水温（25.03±042） ℃，每天投喂两次，表观饱食。投喂 1 h 后吸底换水。实验时间为30 d。

    1.2 样品采集

    实验结束后，从每个盐度每槽中取2尾幼鱼，即每个实验组取6尾鱼，用MS-222麻醉后解剖取其肝脏全部，观察肝脏组织结构。另外，每组再取6尾鱼，麻醉解剖取少许肝脏各两份，分别用于酶活性与基因表达量的测定。

    1.3 肝脏酶活性的测定

    所取肝脏用0.9%的生理盐水冲洗干净，液氮速冻后保存于-80 ℃，用于酶活性测定和免疫基因表达量测定。酶活性检测前取出肝脏，加入肝脏质量9倍的生理盐水，剪碎并研磨后，4 ℃、2 500 r·min-1离心10 min，取上清用以测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）的活性，测定时均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，测定步骤严格按照说明书进行。

    1.4 肝脏组织结构的观察

    取得的两组红鳍东方鲀幼鱼的全部肝脏，均用Bouin氏液固定24 h，之后用75%的酒精对肝脏组织进行洗涤至溶液呈无色，最后放置在70%的酒精中保存以备后期切片制作。制作切片时用常规石蜡包埋，横向连续切片，厚度均为6 μm，HE染色，中性树胶封片[5]。

    1.5 荧光定量检测肝脏相关基因mRNA表达的差异

    根据天根生物公司的动物组织总RNA提取试剂盒说明，提取两个盐度处理下幼鱼的肝脏组织总RNA，OD260/OD280比值在1.9～2.1内的RNA可根据PrimerScriptTM RT Reagent kit試剂盒说明进行反转录反应，所得产物于-20 ℃保存。

    根据NCBI中已报道的红鳍东方鲀IL15（Interleukin 15）（NM_001033048）、IRF2（Interferon regulatory factor 2）（XM_011620053）、TLR3（Toll-like receptor 3）（AC156436）和β-actin（XM_003964421）的基因序列，应用Primer Premier 5.0设计荧光定量引物，如表1所示。以两个盐度下红鳍东方鲀幼鱼肝脏的cDNA为未知样品模板，以β-actin为内参基因，检测IL15、IRF2、TLR3基因的表达量，每个样品设三个平行。最后用2-△△CT方法来计算3个基因的相对表达量[6]。

    1.6 数据处理

    实验所得数据均以平均值±标准差（means±SD）表示，运用SPSS 16.0软件对实验数据进行单因素方差分析，差异显著的进行Tukey法多重比较分析，当P<0.05时表明实验结果差异显著。

    2 实验结果

    2.1 低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏免疫酶活性的影响

    低盐（盐度4‰）胁迫下红鳍东方鲀肝脏免疫酶活性的变化情况见表2。从表2可看出盐度4‰处理后，红鳍东方鲀肝脏中总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）的酶活性显著高于对照组（盐度32‰）的肝脏酶活性。

    2.2 低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏组织结构的影响

    低盐（盐度4‰）胁迫30 d后，红鳍东方鲀幼鱼肝脏中免疫基因IL15、IRF2和TLR3表达量的影响见图2。从图2中可看出，与对照组相比，低盐胁迫下红鳍东方鲀幼鱼肝脏IL15和TLR3的表达量显著升高（P<0.05），而IRF2的表达量却未有显著性差异（P>0.05）。

    3 讨论

    盐度是影响鱼类生存的重要环境因子之一，盐度的变化会导致鱼类体内的酶活性、组织结构和基因表达水平发生变化。肝脏是鱼类体内重要的以代谢为主的器官，在糖类、脂肪和蛋白质的合成与分解代谢中起着至关重要的作用，因此肝脏功能的强弱可作为鱼类抵抗外界环境胁迫能力大小的重要指标。

    鱼类肝脏中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和 碱性磷酸酶（AKP）是评价鱼类非特异免疫性的重要指标。鱼类在一旦受到盐度胁迫，体内会产生大量的活性氧（如过氧化氢、超氧阴离子和羟基自由基），这些活性氧易使鱼类细胞被氧化损伤，进而破坏鱼类机体的生理机能[7-8]。SOD和CAT二者具有消除活性氧以降低细胞损伤的作用，因此，SOD和CAT的活性可反映鱼类机体内细胞的受损程度[9]。本实验中，盐度4‰条件下处理30 d后红鳍东方鲀幼鱼肝脏中SOD、CAT活性显著增强，表明低盐胁迫会导致活性氧自由基在红鳍东方鲀体内积累，进而损伤细胞。ACP和AKP作为巨噬细胞溶酶体酶的重要组成部分可在鱼类机体内的磷酸基团代谢起重要作用，这两种酶亦可催化磷酸酯类的水解产生合成ATP所需的无机磷酸，ACP和AKP以代谢调控酶的形式在免疫反应中产生重要的影响[10]。盐度是影响其变化的重要环境因子，本研究中盐度4‰处理30 d后，ACP、AKP活性显著升高（P<0.05），原因可能是低盐刺激后幼鱼需要消耗ATP来调节机体渗透压以适应盐度的变化，而ACP和AKP催化磷酸酯类水解产生的无机磷酸是合成ATP的材料，因此，低盐胁迫会最终导致ACP和AKP活性的增强。

    说明：1—对照组红鳍东方鲀幼鱼肝组织结构；2—低盐组红鳍东方鲀幼鱼肝组织结构；箭头所指为肝细胞；CV：中央静脉。

    与对照组相比，经盐度4‰胁迫30 d后红鳍东方鲀幼鱼肝脏结构中变化最大的是肝细胞，肝细胞发生肿大膨胀，形状变形。

    2.3 低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏免疫相关基因的影响

    本实验中，经盐度4‰处理30 d后，肝脏组织结构中肝细胞体积增大，可能是由于红鳍东方鲀幼鱼为了适应低盐度环境，将体内的更多的能量用于机体渗透压的调节，在此过程中，糖酵解反应的进行使得肝脏中肝糖原得以大量积累，由此可供机体内部所需的大量能量，而肝糖原的过多积累则会导致肝细胞体积的增大膨胀[11]。

    白细胞介素（IL）主要在信号传递、调節细胞增殖与分化等方面起作用[12]。白细胞介素15（IL15）是重要的细胞因子之一，具有多种功能，如刺激T细胞和B细胞增殖、诱导免疫球蛋白分泌、促进转录蛋白合成等。干扰素调节因子（IRF）是一种转录因子，主要调节I型干扰素、干扰素刺激基因的表达[13]。Toll样受体（TLRs）是一种跨膜受体，位于细胞表面，主要作用于信号传导，在识别病原、激活先天免疫和诱导适应性免疫方面具有重要作用[14]。目前，在硬骨鱼类中发现了 17 种TLRs[15]，TLR3是其中之一。本实验中，低盐处理30 d后红鳍东方鲀幼鱼肝脏IL15和TLR3基因的表达量显著升高（P<0.05），说明红鳍东方鲀幼鱼在受到盐度胁迫时，免疫相关基因表达水平的增加可增强机体的免疫能力，从而有效的抵抗外界环境变化带来的影响。

    综上所述，低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏酶活性（SOD、CAT、ACP、AKP）、组织结构、免疫相关基因（IL15、IRF2、TLR3）的表达水平具有重要影响，而这些指标的变化会加强幼鱼的免疫能力。此结果可为红鳍东方鲀的低盐化养殖提供理论依据和基础材料。

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    （收稿日期：2016-12-01）