１２株奶牛乳房炎链球菌的分离、鉴定和耐药性分析
王海燕 李碧春 陈琳
摘要：为了解扬州、泰州地区引起奶牛乳房炎的主要病原体，于2015年11月至2017年6月期间对扬州、泰州地区奶牛场送检的乳房炎奶牛的乳样进行病原体分离，共分离鉴定出11株无乳链球菌菌株，1株乳房链球菌菌株。使用卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、氨苄西林、头孢氨苄、头孢西丁、多黏菌素B、红霉素、四环素、万古霉素、氧氟沙星、阿奇霉素等药物进行了耐药性试验，结果表明，分离菌对卡那霉素、庆大霉素、氨苄西林和多黏菌素B等药物有一定的耐药性，对其他几种药物敏感。
关键词：奶牛;乳房炎;病原菌;药敏试验
中图分类号：S858.23? ? ? ? 文献标识码：A? ? ? ? 文章编号：1007-273X（2019）10-0005-03
奶牛乳房炎是指病原微生物侵入奶牛乳腺组织或外伤、化学刺激乳腺组织所引起的奶牛乳房炎症[1]。乳房炎是奶牛最常见的疾病，不仅会影响产奶量和牛奶品质，也因治疗时间长、大量使用多种抗生素，造成药物残留和细菌耐药性的产生。我国关于奶牛乳房炎发病率的报道在46%～70%[2，3]。
引起奶牛乳房炎病原菌种类较多，有时为多重感染，最常见的是金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌和大肠杆菌[4]。链球菌属致病菌，感染奶牛乳房后所引起的临床症状不明显，从而不易被牛场察觉，危害极大，最直观的经济损失是奶牛乳产量下降，牛奶品质变差。链球菌是革兰氏阳性菌，有荚膜[5]，荚膜及其M蛋白在致病过程中起到重要作用[6]。无乳链球菌属于B群链球菌，荚膜多糖、神经氨酸酶等是其重要的毒力因子[7]，一些菌株具有溶血特性。部分β型溶血型链球菌致病力强，可引起多种化脓性疾病，产生溶血素、CAMP因子、透明质酸酶和神经氨酸酶等毒性因子[8]。停乳链球菌（GCS）为溶血链球菌，能分泌透明质酸、O型溶血素和纤维蛋白溶解酶[9]。这些毒力因子在致病过程中起到关键作用。
为了解扬州、泰州地区奶牛乳房炎的主要病原体，对送检的牛乳样本进行了病原分离和鉴定，并进行了耐药性试验。
1? 方法
1.1? 细菌分离
将送检乳样无菌接种于绵羊血琼脂平板，37 ℃培养24 h，观察是否有菌落生成并进行3次传代纯化，最终记录菌落结果。
1.2? 染色镜检
对分离得到的菌株进行革兰氏染色，镜检。
1.3? 生化试验
利用细菌微量生化反应管（购于杭州微生物试剂有限公司，操作方法与判定标准参照说明书）对分离所得菌株进行生化指标测定。在37 ℃条件下培养24 h，与对照管比对，观察反应结果并记录。
1.4? PCR扩增与测序、分析
使用TaKaRa 16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒对分离株的16s rRNA基因进行扩增。PCR按照试剂盒说明书进行，体系见表1。PCR反应参照试剂盒提供的条件：94 ℃预变性5 min，变性1 min，退火温度53 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，再延伸5 min，共30个循环。对扩增产物进行序列测定、BLAST，根据同源性高低确定细菌种属。
1.5? 药敏试验
使用卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、氨苄西林、头孢氨苄、头孢西丁、多黏菌素B、红霉素、四环素、万古霉素、氧氟沙星、阿奇霉素等药物进行分离菌株的耐药性试验。
2? 结果与分析
2.1? 细菌分离结果和菌落形态
牛乳样本接种血平板，37 ℃培养24 h后长出菌落，挑取菌落进一步鉴定。分离出12株菌落的形态和特征见表2和图1。
2.2? 染色镜检
12株菌株均呈短链状，革兰氏染色均有不同程度的蓝色，为革兰氏阳性菌，符合链球菌的特征。
2.3? 生化结果
对分离的12株链球菌菌株进行了生化特性试验，符合链球菌的生化特性，结果见表3。
2.4? 测序结果
16s rRNA基因序列进行了BLAST分析，均为链球菌，其中无乳链球菌11株，乳房链球菌1株，序列提交GenBank，登录号见表4。
2.5? 药敏试验结果
分离菌对卡那霉素、庆大霉素、氨苄西林和多黏菌素B等药物有一定的耐药性，对其他几种药物敏感（表5），判定标准见表6。
3? 讨论
3.1? 奶牛乳房炎病原菌
试验分离得到的12株链球菌菌株，其中无乳链球菌11株，乳房链球菌1株，说明该地区的奶牛乳房炎病例中无乳链球菌较多。乳房炎病例中，金黄色葡萄球菌是最多的病原菌[10]，链球菌分离率仅次于金黄色葡萄球菌，链球菌性乳房炎引起的临床症状不明显，不易被察觉，但造成的危害极大，使奶牛乳产量明显下降，品质变差，它们不仅感染乳房腺体，也会对奶牛乳腺组织造成不可逆的损伤与破坏，导致乳腺泌乳功能受损甚至完全丧失[11]。无乳链球菌专性寄生于奶牛乳腺、乳头和生殖道，可引起婴幼儿的败血症、脑膜炎、肺炎[12]，对青霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素等较为敏感。根据本试验得到的结果可以看出，受试药物中有部分药物，如红霉素在奶牛的使用上还有一定的空间。氯霉素在兽医上已经是禁用药物，对庆大霉素有一定的抗药性，分离菌对阿莫西林、万古霉素和阿奇霉素等药物敏感，可用于临床上的感染控制。
3.2? 奶牛乳房炎的防治
雖然抗生素能有效治疗奶牛乳房炎，但药物残留危害人类健康，同时又产生耐药性，因此不能依赖抗生素。近年来，中草药治疗乳房炎的研究越来越多，中草药通过提高非特异性免疫和抗菌作用实现对奶牛乳房炎的治疗[13-15]。奶牛乳房炎发生时很多是隐形感染的，挤奶时交叉感染会造成大规模乳房炎，奶牛场本身的管理因素，通风不良、卫生问题等也为病原菌传播提供了一定条件，因此，及时对奶牛进行体检、保证奶牛场环境也非常重要。
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