壬基酚对中华新米虾几种生化指标的影响

    王建霞+李林锋+赵文博+王亚欣+孙绍永+赵春龙+王宏伟

    中华新米虾（Neocaridina denticulata sinensis）属于甲壳纲，十足目，匙指虾科，米虾属。中华新米虾是一种小型淡水虾类，具有生长迅速，生命力顽强，对环境的适应能力较强，生长周期短，容易饲养等优点，是一种优良的实验材料。

    壬基酚（nonylphenol，NP）被广泛用于非离子润滑油添加剂、表面活性剂、洗涤剂等，因而也成为重要的环境污染物。壬基酚是一种环境内分泌干扰物，具有一定的类雌激素样作用，严重影响雄性生物的生殖能力。据统计，全世界每年大约有50万吨的NP进入水体或土壤，被水生生物所摄取并对其产生毒害，NP在其体内积累，通过食物链对人类造成影响。

    根据文献[1]报道水体中含有壬基酚的浓度，以20.1 μg/L作为环境剂量，研究壬基酚对中华新米虾肌肉内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S转移酶（GST）、丙二醛（MDA）的作用，通过测定SOD、GST、MDA、蛋白质含量，研究壬基酚对水体中中华新米虾肌肉内的酶的毒害作用，进而研究NP对中华新米虾的影响。

    1材料和方法

    中华新米虾采于河北白洋淀，对中华新米虾进行分组养殖，实验期为30 d，养殖期间保持养殖水体温度在23～26 ℃，pH 7.8～8.3，溶氧量>5 mg/L。实验用自制饲料（饲料配方主要参照Wang H W et al. [2]的实验饲料配方）。根据文献[2]结果，设定环境中壬基酚的环境剂量为20.1 μg/L。用南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽—S转移酶（GST）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒，按照试剂盒的步骤测定SOD， 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O2-.），O2-.可将氮蓝四唑（NBT）还原为蓝色的甲臜（formazan），后者在560 nm处有吸收。SOD可清除O2-.，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。测定GST，GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340 nm；通过测定340 nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。测定MDA，测定方法是丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物3，5，5′-三甲基恶唑2，4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一吸收高峰，并且在660 nm处有较小光吸收。根据其532 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。

    2结果与分析

    空白对照组和酒精对照组中由于不含有壬基酚，随着时间的变化这两组中SOD活力没有显著变化，环境剂量组中，SOD活力较低，说明水环境中壬基酚对中华新米虾SOD有抑制作用；在2倍环境剂量和5倍环境剂量中SOD活力随时间有显著下降趋势。而2倍环境剂量和5倍环境剂量中SOD活力明显高于环境剂量组，说明较高浓度的壬基酚又刺激SOD活力升高来抵御胁迫（见图1）。

    壬基酚对中华新米虾胁迫实验中，空白组和酒精对照组，GST活力呈现先降低，10 h又上升的趋势，说明无胁迫酶活力可以恢复。而在环境剂量和2倍环境剂量GST活力下降明显，说明水环境中壬基酚对中华新米虾GST有抑制作用，在5倍环境剂量中，GST活力总体随时间也呈下降趋势，说明一定剂量的壬基酚对中华新米虾肌肉谷胱甘肽转移酶活性有胁迫作用，与对照组相比，差异显著。而5倍环境剂量明显高于环境剂量组和2倍环境剂量中GST活力，说明较高浓度的壬基酚又刺激GST活力升高来抵御胁迫，而刺激GST提高的浓度略高于刺激SOD提高的壬基酚浓度 （见图2）。

    空白对照组MDA含量远远高于其他组（見图3），说明不同浓度的壬基酚对中华新米虾中的MDA都有较大影响。

    3讨论

    杨丽丽、方展强[3]的研究发现低浓度的壬基酚对唐鱼体内SOD的含量没有明显变化，但是高浓度的壬基酚使唐鱼体内的SOD含量明显上升。我们的实验结果表明中华新米虾在不高于5倍环境剂量的条件下，SOD的活力是下降的，这表明壬基酚对中华新米虾有一定的毒性作用，使其组织损伤，超氧化物歧化酶活力降低。在曹燕花，王茜对小白鼠的研究[4]有类似的发现，与对照组肝脏SOD的活力、MDA 含量的比较，没有明显差异。高剂量组与低剂量组肾脏SOD 活力、MDA 含量比较，差异显著（P<005），随染毒NP浓度升高，SOD活力降低，MDA 含量升高。各剂量组子宫NOS 活力比较差异显著（P<0.05），随染毒壬基酚浓度升高，NOS 活力下降。结论NP可导致雌性大鼠肾脏SOD 活力降低、MDA 含量升高，且导致子宫中NOS 活力降低，说明壬基酚对肾脏及子宫造成了氧化损伤作用，对肝脏无氧化损伤作用。由此也说明NP主要对生物的生殖系统造成伤害[5]。

    GST作为动物体内一种重要的解毒酶，能敏感地感觉到环境中壬基酚的变化。丁秀荣，李正炎对牙鲆的研究[6]表明，低浓度的NP对GST活性的诱导率为127.5%，高浓度的诱导率为373%。本实验也有类似的结果，当中华新米虾处于环境剂量时，GST的活力呈规律性下降趋势，当试验用虾处于2倍环境剂量或5倍环境剂量时，GST活力开始下降。由于NP是一种对生殖系统有毒害作用的物质，所以适当的浓度的NP会激发生物产生较多的GST来抵抗环境的变化，但是如果环境中NP浓度过高超过了生物的耐受能力，那么生物体内的GST将降低，通过NP对生物体内GST的活力影响，可以检测环境中NP污染物的量。

    对于MDA的检验，数据呈现不规律状态，似乎对后续实验没有任何指导意义，但是参阅了孙建光，王文勇，刘舒婷对金鱼的研究[7]发现，出现上述规律是正常的，NP对组织中含有的MDA随着剂量的不同而不同，在一定范围内有着剂量-效应关系。剂量超出一定范围后，这种关系不再明显。在时间-效应关系上低剂量组时间效应较弱，高剂量组时间积累效应较强，中剂量组时间积累效应最强。

    壬基酚（NP）对于中华新米虾有很强的毒害作用，能使其肌肉内SOD活力明显下降，并且随着时间的延长，这种积累会加深。中华新米虾在环境剂量组和2倍环境剂量组中GST活力下降明显，5倍环境剂量的实验用虾GST活力没有明显变化。从时间角度分析，NP使实验用虾肌肉内GST活力下降。NP对于MDA的影响较大，无论是环境剂量还是2倍环境剂量都使实验用虾肌肉内MDA含量急剧减少。

    由于NP是一种对生殖系统有毒害作用的物质[8]，所以适当浓度的NP会激发生物产生较多的GST来抵抗环境的变化，但是如果环境中NP浓度过高超过了生物的耐受能力，那么生物体内的GST将降低，通过NP对生物体内GST的活力影响，可以反映环境中NP污染物的毒性。

    参考文献：

    [1]

    Wang HW， Cai DB， Xiao GH. Effects of Selenium on the activity of antioxidant enzymes in the shrimp， Neocaridina heteropoda[J]. The Israeli Journal of Aquaculture – Bamidgeh， 2009， 61（4）：322-329

    [2] Wang HW， Zhao WB， Zhang J， Cai DB， Yin R， Zhang LL， Lu SS， Yang FK. Effects of Nonylphenol on the Enzyme Activity of ERND in Gastropods （Cipangopaludina chinensis） [J]. Advanced Materials Research Vols. 2015，1073-1076，253-255

    [3] 楊丽丽，方展强.雌二醇、壬基酚、多氯联苯、镉和锌暴露对唐鱼体内超氧化物歧化酶活性的影响[J].中国实验动物学报，2012，20（1）：38-45

    [4] 曹燕花，王茜，李清钊，等.壬基酚对雌性大鼠肝、肾及子宫的氧化损伤作用[J].环境与健康杂志，2010，03（27）：233-234

    [5] 李玉白， 曾琦斐，刘劭钢.壬基酚毒性作用的研究[J].医学理论与实践，2006，19（4）：375-376.

    [6] 丁秀荣，李正炎，王波，等.壬基酚对牙鲆肝脏EROD和GST酶活性的影响[J].中国海洋大学学报，2007，37（sup.）：101-104

    [7] 孙建光，王文勇，刘舒婷.壬基酚对金鱼丙二醛含量变化率的影响[J].科技信息，2009，33（1）：50-52

    [8] Kolanjiappan， K.， Manoharan， S.， Kayalvizhi， M.， 2002. Measurement of erythrocyte lipids， lipid peroxidation， antioxidants and osmotic fragility in cervical cancer patients[J]. Clinica Chimica Acta 326，143-149

    （收稿日期：2016-12-05）