脂肪酸标志法研究池塘悬浮颗粒物及附着基生物组成的季节性变化对刺参食物来源的影响

    张乘　高勤峰　高永刚　李卫东

    摘要：分别以16∶1（n-7）/16∶0和EPA作为硅藻特征脂肪酸标志；20∶4（n-6）作为褐藻特征脂肪酸标志；DHA及DHA/EPA作为原生动物特征脂肪酸标志；18∶1（n-7）和odd & br FAs作为细菌特征脂肪酸标志，研究分析了悬浮颗粒物的生物组成的季节变化、附着基附着物的生物组成的季节变化以及二者对刺参食物来源组成的影响。分析结果表明，硅藻、鞭毛藻或原生动物及多种异养细菌均为悬浮颗粒物的主要生物组成，且各类生物组成比例的季节变化显著（P<0.05）；硅藻、褐藻、鞭毛藻或原生动物及多种异养细菌均为附着基附着物的重要生物组成，且各类生物组成比例的季节变化显著（P<0.05）。对比悬浮颗粒物、附着基及刺参的食物组成可以发现，附着基附着物对刺参的食物组成有重要的贡献，悬浮颗粒物也是刺参的食物来源之一。

    关键词：悬浮颗粒物；附着基；刺参；生物组成；脂肪酸标志法；食物来源

    中图分类号：S966

    文献标识码：A

    脂肪酸是所有生物体的重要组分，是迄今所知的细菌体、微藻类、陆地高等植物、海洋动物区系中含量最高的脂类物质，主要以三羧酸甘油脂和磷脂的形式存在[1]。作为生物标志物，脂肪酸有几大优越性：第一，生物体脂肪酸的组成和累积是长期摄食活动的结果，因而以脂肪酸为示踪判断生物食性可以有效降低因生物的偶食性引起的偏差；第二，脂肪酸在生物体新陈代谢过程中比较稳定，经生物消化吸收后结构基本保持不变；第三，动物自身无法合成必需脂肪酸，其体组织内的必需脂肪酸只能依赖于其所摄入的食物，从而提高了以必需脂肪酸作为营养标志物进行食性溯源的可信度[2-5]。

    目前，脂肪酸标志法已广泛应用于海洋生物食物关系的相关研究中[6-11]，高菲等[12]通过分析刺参体组织脂肪酸的变化，运用脂肪酸标志法推断刺参食物来源的季节性变化，没有分析食物环境中脂肪酸组成的变化。本研究同时分析了刺参养殖池塘悬浮颗粒物、附着基附着物和刺参体组织脂肪酸组成的季节性变化及二者之间的相关性，以阐明食物环境的变化对刺参食物来源的影响，揭示池塘养殖刺参食性的季节性变化。

    1材料和方法

    1.1样品采集

    實验于2012年5-12月在山东好当家海洋发展股份有限公司靖海湾刺参养殖基地（37°17′N，122°42′E）进行。实验期间采集刺参、悬浮颗粒物及附着基样品四次，采样时间为2012年5月20日、8月10日、10月12日和12月23日，分别代表春季、夏季、秋季和冬季样品，每次采样均设四个相同站点。样品采集时，从每个站点随机选取刺参12～16头，用无菌纱布擦干并去除石灰环后，剪取体壁组织。每2～3头刺参的体壁组织合并作为一个样本置于-80 ℃冷冻保存，每个站点刺参样品设置5个重复；使用药勺轻轻刮取附着基（附着基由6个直径 15 cm、长40 cm的聚氯乙烯带孔空管捆绑组成）表面的附着物，每个站点附着基样品设置4个重复；用采水器于每个站点15 m水深处采集2 L水样，采集到的水样立即用在马弗炉中 450 ℃ 下灼烧4～5 h左右的玻璃纤维膜（GF/F，孔径0.7 μm，直径45 mm）真空过滤，收集水体中的悬浮颗粒物；每个站点的悬浮颗粒物样品设置4个重复；刺参、附着基及悬浮颗粒物样品冷冻干燥至恒重，用组织粉碎机粉碎后，于-80 ℃ 密封保存备用。实验器具均用10%盐酸浸泡，并用二次蒸馏去离子水冲洗。

    1.2样品处理

    （1）称取80 mg冷冻干燥后的刺参样品或300 mg冷冻干燥后的附着基或合并的同一围隔的2张GF/F膜样，置于10 mL试管中。加入1N KOH-甲醇溶液3 mL（附着基附着物和悬浮颗粒物样品另加1 mL氯仿）后，超声波处理30 min以破碎细胞壁。处理后的溶液于75～80 ℃水浴中加热15～20 min，然后放置冷却至室温。

    （2）加2N HCl-甲醇溶液3 mL，于75～80 ℃水浴中加热20 min，冷却至室温。

    （3）加正己烷1 mL，振荡萃取，静止分层（需要时稍加水有助分层）。

    （4）将上清液转移到1 mL塑料离心管中，1 000 r/min离心5 min。取上清液并转移至GC小瓶中待测。

    1.3脂肪酸测定

    1.3.1仪器色谱仪：日本岛津公司GC2010型气相色谱仪。

    1.3.2色谱条件使用RTX-wax型毛细管柱，长度30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm，温度上限250 ℃。升温程序设置为：120 ℃ 保持1 min，经10 ℃/min到190 ℃，再经2 ℃/min升至236 ℃，平衡2 min。汽化室温度260 ℃，检测器温度260 ℃，分流比15∶1，使用FID检测器，载气为氢气，进样体积为1 μL。

    1.3.3选用的脂肪酸标记物

    细菌特征脂肪酸——18∶1（n-7）；奇数碳/支链脂肪酸（odd & br FAs）[14]

    硅藻特征脂肪酸——16∶1（n-7）/16∶0；EPA[14]

    原生动物特征脂肪酸——DHA[14]

    褐藻特征脂肪酸——20∶4（n-6）[14]

    1.4数据分析

    本实验结果中，数据以平均值±标准差（mean±SD）表示。采用SPSS13.0 软件进行方差分析比较细菌特征脂肪酸、硅藻特征脂肪酸、原生动物特征脂肪酸及褐藻特征脂肪酸在不同季节之间的差异显著性，并用Tukey检验法进行多重比较，以P<0.05作为方差分析的显著水平[15-16]。

    2结果

    2.1悬浮颗粒物的脂肪酸组成的季节变化

    GF/F膜样品中饱和脂肪酸（SFA）比例最高，主要为14∶0，16∶0，18∶0；单不饱和脂肪酸（MUFA）主要为16∶1（n-7）、18∶1（n-7）和18∶1（n-9）；多不饱和脂肪酸（PUFA）主要为20∶4（n-6）、20∶5（n-3）和22∶6（n-3）。

    悬浮颗粒物的硅藻类特征性脂肪酸标志季节变化如表1。由表1可以看出，16∶1（n-7） /16∶0季节变化明显（P<0.05），最高值在12月出现，5月最低。EPA季节变化显著（P<0.05），且与16∶1（n-7）/16∶0变化规律一致，最高值出现在12月，最低值出现在5月。硅藻类特征性脂肪酸季节变化显著（P<0.05），说明该采样海区冬季硅藻的相对含量较高。

    如表1悬浮颗粒物中褐藻特征性脂肪酸20∶4（n-6）具有明显的季节变化（P<0.05），最高值在8月出现（百分含量均值为6.35%），5月份20∶4（n-6）的百分含量均值为0.95%，十二月份的GF/F膜样品中未检测到20∶4（n-6）。

    所测GF/F膜样品中的鞭毛藻或原生动物脂肪酸DHA含量较高，实验期间百分含量在811%～22.28%之间，季节变化明显（P<005），最高值在5月出现。海参体壁DHA/EPA的季节变化规律与DHA变化规律一致，最高值出现在5月。说明5月该池塘悬浮颗粒物中鞭毛藻或原生动物的含量较高。

    细菌特征性脂肪酸为18∶1（n-7）和Odd & br FAs，其季节变化明显规律（P<0.05），18∶1（n-7）相对含量在实验期间变化显著（P<005），春秋季节较高，夏冬季节较低。18∶1（n-7）变化规律与 Odd& br FAs 较一致，最低值出现在 8月份，最高值出现5月并且显著高于 8 月（P<0.05）。

    2.2附着基附着物的组成的季节变化

    附着基附着物中饱和脂肪酸的主要成分是16∶0，其次为14∶0和18∶0。16∶1（n-7）、18∶1（n-9）、18∶1（n-7）、22∶1（n-11）是单不饱和脂肪酸中的主要成分。多不饱和脂肪酸中DHA、EPA、20∶4（n-6）为主要成分。

    2.2.1附着基附着物中硅藻特征性脂肪酸标志季节变化

    附着基附着物中硅藻类特征性脂肪酸标志物的季节变化如图1。由图1a可以看出，16∶1（n-7）/16∶ 0比值较高（比值为1.42～2.36，其均值为1.84），季节变化明显（P<0.05），最高值在12月出现（2.24±0.12），10月最低。由图1b可以看出，EPA季节变化显著（P<0.05），且与16∶1（n-7）/16∶ 0變化规律一致，最高值出现在12月，最低值出现在8月。硅藻类特征性脂肪酸季节变化显著，说明冬季硅藻在附着基附着物中的相对含量较高，夏季较低。

    2.2.2附着基附着物中褐藻特征性脂肪酸标志季节变化

    褐藻特征性脂肪酸20∶4（n-6）在附着基附着物中的含量较高，实验期间百分含量在4.93%～8.36%，由图2可以看出，季节变化明显（P<0.05），最高值在8月出现，12月最低。褐藻类特征性脂肪酸季节变化显著（P<0.05），说明8月褐藻在附着基附着物中的含量较高，12月较低。

    2.2.3附着基附着物中鞭毛藻或原生动物脂肪酸标志物的季节变化

    鞭毛藻或原生动物特征性脂肪酸DHA在附着基附着物中的百分含量较高，实验期间百分含量在10.25%～16.17%之间，由图3a可以看出，DHA的季节变化明显（P<0.05），其百分含量的最高值在12月出现，最低值出现在10月。如图3b，附着基附着物中的DHA/EPA的季节变化规律与DHA变化规律一致，12月较高，10月较低。

    2.2.4附着基附着物中细菌脂肪酸标志物的季节变化

    如图4，细菌特征性脂肪酸18∶1（n-7）的相对含量在实验期间变化显著（P<0.05），夏季较高（6.09±0.16%），显著高于冬季（3.01±012%）（P<0.05）；Odd& br FAs的相对含量在实验期间变化显著（P<0.05），最低值出现在 5月份（1.95±0.12%），最高值出现在8月（3.54±0.11%）。

    2.3刺参体壁脂肪酸组成的季节变化

    2.3.1刺参体壁中主要脂肪酸组成的季节变化如表2所示，刺参体壁的脂肪酸碳链较长，多不饱和脂肪酸所占比例较大，其碳原子数在14到22之间，共30种。其中饱和脂肪酸检测到八种，四个季节中16∶0均为SFA中含量最高的组分，占脂肪酸总含量的6.43%～14.75%。单不饱和脂肪酸检测到八种，四个季节中16∶1（n-7）、18∶1（n-9）和18∶1（n-7）均为主要组分。多不饱和脂肪酸检测到10种，其中DHA、EPA和20∶4（n-6）为其主要组分。支链脂肪酸检测到四种，主要为i14∶0，i15∶0，ai15∶0和i16∶0。

    2.3.2刺参体壁特征性脂肪酸的综合分析以7 种脂肪酸标志16∶1（n-7）/16∶0、EPA、20∶4（n-6）、DHA、DHA/EPA、18∶1（n-7）和Odd & br FAs在刺参体壁的百分含量或比值为变量，对不同时期采集的刺参样品进行主成分分析，综合分析刺参食物组成的季节变化。各脂肪酸标志在第一（principal component，PC1） 、第二主成分（PC2）上的分值见表3。第一、第二主成分对食物来源季节变化的贡献率达95.2%，表明这两个主成分基本能反映刺参食物来源在不同季节的差异。第一主成分的贡献率达78.3%，特征值较高的为硅藻特征性脂肪酸EPA和16∶1（n-7）/16∶0、细菌性特征性脂肪酸18∶1（n-7）和Odd & br FAs以及鞭毛藻或原生动物特征性脂肪酸DHA，其中Odd & br FAs与其他的脂肪酸标志物呈负相关。第二主成分的贡献率为16.9%。

    3讨论

    刺参为沉积食性[17-21]，饵料成分复杂，目前有关刺参食物来源的研究通常采用消化道内含物分析法[17]，但消化道内含物分析法只能反映生物被采集时所摄取的食物，且刺参还可以通过表皮从海水中吸收部分溶解的有机质[21-22]。相比之下，脂肪酸标志法则可以通过分析生物体经消化作用以后吸收的食物成分的脂肪酸构成，反映最近一段时期内生物的食物来源[21，23-25]。Cook等[26]用脂肪酸标志法分析不同生境中海胆食物来源组成的研究表明海胆的食物来源与其栖息环境有密切关系。因此本实验选用脂肪酸标志法分析附着基附着物及悬浮颗粒物的生物组成及其对刺参食物来源的影响。

    用脂肪酸标志法研究悬浮颗粒物的生物组成的季節变化的结果显示，硅藻特征性脂肪酸16∶1（n-7） /16∶0季节变化显著（P<0.05），最高值在12月出现，5月最低；硅藻另一特征性脂肪酸EPA季节变化规律与16∶1（n-7）/16∶0一致，最高值亦出现在12月，最低值出现在5月。由硅藻的硅藻类特征性脂肪酸的季节变化可以看出，该采样海区冬季硅藻的相对含量较高。悬浮颗粒物中褐藻特征性脂肪酸20∶4（n-6）具有明显的季节变化（P<0.05），最高值在8月出现（百分含量均值为6.35%），说明该采样海区夏季褐藻的相对含量较高。所测GF/F膜样品中的鞭毛藻或原生动物脂肪酸DHA含量较高，实验期间其百分含量在8.11%～22.28%之间，季节变化明显（P<0.05），最高值在5月出现，说明5月该池塘悬浮颗粒物中的鞭毛藻或原生动物的含量较高。支链脂肪酸为细菌特有的脂肪酸，Odd & br FAs主要指示噬纤维菌-黄杆菌类（Cytophaga-Flavobacteria），18∶1（n-7）主要指示变形细菌（Proteobacteria）。悬浮颗粒物中的细菌特征性脂肪酸18∶1（n-7）和Odd & br FAs具有明显的季节变化规律（P<0.05），18∶1（n-7）相对含量在实验期间变化显著（P<0.05），春秋季节较高，夏冬季节较低。18∶1（n-7）变化规律与 Odd& br FAs 较一致，最低值出现在 8月份，最高值出现5月并且显著高于 8 月（P<0.05）。说明该采样池塘春秋季节变形细菌的含量较高，噬纤维菌-黄杆菌类春季含量较高。对比刺参体壁与悬浮颗粒物中的特征性脂肪酸的季节变化可以看出，悬浮颗粒物中的硅藻类特征性脂肪酸、鞭毛藻或原生动物的特征性脂肪酸的变化规律与刺参体壁的硅藻类特征性脂肪酸、鞭毛藻或原生动物的特征性脂肪酸的变化规律较为一致，说明悬浮颗粒物也是海参的食物来源之一。

    用脂肪酸标志法研究附着基附着物的生物组成的季节变化的结果显示，硅藻类特征性脂肪酸16∶1（n-7） /16∶0与EPA均具有显著的季节变化（P<0.05），且二者变化规律一致，12月最高，8月和10月较低，说明冬季硅藻在附着基附着物中的相对含量较高，夏季较低。褐藻特征性脂肪酸20∶4（n-6）在附着基附着物中的含量较高，实验期间百分含量在4.93%～8.36%，褐藻特征性脂肪酸20∶4（n-6）的季节变化显著（P<0.05），最高值出现在8月，最低值出现在12月，说明夏季褐藻在附着基附着物中的含量较高，冬季较低。实验期间鞭毛藻或原生动物的特征性脂肪酸DHA在附着基附着物中的百分含量较高，在10.25%～16.17%之间。附着基附着物中的DHA和DHA/EPA的季节变化明显（P<005），且变化规律一致，12月较高，10月较低，说明附着基附着物中的鞭毛藻或原生动物的相对含量在冬季较高，夏季较低。支链脂肪酸为细菌特有的脂肪酸，Odd & br FAs主要指示噬纤维菌-黄杆菌类，18∶1（n-7）主要指示变形细菌。实验期间附着基附着物中的细菌特征性脂肪酸为18∶1（n-7）和Odd&br FAs的相对含量的季节变化显著（P<0.05），18∶1（n-7）的相对含量的最高值出现在8月（6.09±0.16%），显著高于12月（3.01±0.12%）（P<0.05）；Odd&br FAs的相对含量在实验期间变化显著（P<0.05），最低值出现在 5月份（1.95±0.12%），最高值出现在8月（3.54±0.11%）；说明噬纤维菌-黄杆菌类和变形细菌在附着基附着物中的含量为夏季最高。对比刺参体壁与附着基中的特征性脂肪酸的季节变化可以看出，附着基附着物中的硅藻类特征性脂肪酸、鞭毛藻或原生动物的特征性脂肪酸的变化规律与刺参体壁的硅藻类特征性脂肪酸、鞭毛藻或原生动物的特征性脂肪酸的变化规律比较一致，说明附着基附着物对刺参的食物组成有重要的贡献。

    综上可以看出，硅藻、鞭毛藻或原生动物及多种异养细菌均为悬浮颗粒物的主要生物组成，且各类生物组成比例的季节变化显著（P<0.05）；硅藻、褐藻、鞭毛藻或原生动物及多种异养细菌均为附着基附着物的重要生物组成，且各类生物组成比例的季节变化显著（P<0.05）。对比悬浮颗粒物、附着基附着物及刺参的食物组成可以发现，附着基附着物对刺参的食物组成有重要的贡献，悬浮颗粒物也是刺参的食物食物来源之一。

    参考文献：

    [1]

    Henderson， R.J.Fatty acid metabolism in freshwater fish with particular reference to polyunsaturated fatty acids[J].Archives of Animal Nutrition， 1996，49：5-22

    [2] Sargent J， Parkes R J， Mueller-Harvey I， et al.Lipid biomarkers in marine ecology [M].Sleigh M A， ed.Microbes in the sea. Chichester： Ellis Harwood， 1987

    [3] Viso A C， Marty J C.Fatty acids from 28 marine microalgae [J].Phytochemistry （Oxf）， 1993， 34： 1521-1533

    [4] Dunstan G A， Volk man J K， Barrett S M， et al.Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom （Bacillariophyceae） [J].Phytochem， 1994， 35（I）：155-161

    [5] 许强.贝藻混养系统中贝类食物来源的定量分析[D].青島：中国科学院海洋研究所，2007，57-77

    [6] Chuecas L， Riley J P.Component fatty acids of the total lipids of some marine phytoplankton [J].J.Mar Biol Assn， 1969， 49： 97-116

    [7] Hebert C E， Arts M T， Weseloh D V C.Ecological tracers can quantify food web structure and change [J].Environ-mental Science and Technology， 2006， 18：5 618-5 623

    [8] Dorothea S， Wilhelm H.On the use of lipid biomarkers in marine food web abalyses： an experimental case study on the Antarctic krill， Euphausia superba [J].Limol Oceanogr， 2003，48（4）： 1 685-1 700

    [9] Caers M， Coutteau P， Sorgeloos P， et al.Impact of algal diets and emulsions on the fatty acid composition and content of selected tissues of adult broodstock of the Chilean scallop Argopecten pupuratus（Lamarck， 1819） [J].Aquaculture， 2003， 217（1-4）：437-452

    [10] Ju S J， Harvey H R.Lipids as markers of nutritional condition and diet in the Antarctic krill Euphausia superba and Euphausia crystallorophias during austral winter [J].Deep-Sea ResⅡ， 2004， 51（17-19）： 2199-2214

    [11] Dalsgaard J， St John M， Kattner G， Muller-Navarra D， Hagen W （2003） Fatty acid trophic markers in the pelagic marine environment[J].Adv Mar Biol 46：225-340

    [12] 高菲，许强，杨红生.运用脂肪酸标志法分析刺参食物来源的季节变化[J].水产学报 2010，34（5）： 760-767

    [13] Li X， Fan X， Han J， et al.Fatty acids of some algae from the Bohai Sea [J]. Phytochemistry， 2002， 59 （2）：157-161

    [14] 李宪璀，范晓，韩丽君，等.中国黄、渤海常见大型海藻的脂肪酸组成[J].海洋与湖沼，2002，33（2）： 215-224

    [15] Falch E， Rustad T， Jonsdottir R， et al.Geographical and seasonal differences in lipid composition and relative weight of by-products from gadiform species [J].J Food Compos Anal， 2006， 19（6-7）：727-736

    [16] Gao F， Yang H， Xu Q， et al.Phenotypic plasticity of gut structure and function during periods of inactivity in Apostichopus japonicus [J].Comp Bio Phy Part B， 2008， 150（3）： 255-262

    [17] 王秀云， 何振平， 刘艳芳， 等.刺参与日本对虾池塘高效混养技术[J].河北渔业，2008（6）：19-21

    [18] 隋锡林.海参增养殖 [M].北京： 中国农业出版社，1988

    [19] 李文权，李芋，廖启斌，等.温度对四种海洋微藻脂肪酸组成的影响[J].台湾海峡，2003（l）：9-13

    [20] 邹宁，郭小燕，孙东红，等.固定化培养底栖硅藻研究[J].中国水产，2005（6）：72-73

    [21] Péquignat E.Skin digestion and epidermal absorption in irregular and regular urchins and their probable relation to the outflow of spherule-coelomocytes [J].Nature （Lond）， 1966， 210（5034）： 397-399

    [22] Péquignat E.Some new data on skin digestion and absorption in sea urchins and sea stars （Asterias and Hericia） [J].Mar Biol， 1972， 12（1）： 28-41

    [23] Fukuda Y， Naganuma T.Potential dietary effects on the fatty acid composition of the common jellyfish Aurelia aurita [J].Mar Biol， 2001， 138 （5）：1029-1035.

    [24] Irsch.P E， Iverson S J， Bowen W D， et al.Dietary effects on the fatty acid signature of whole Atlantic cod（Gadus morhua） [J].Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences， 1998， 55（6）： 1378-1386

    [25] Pazos A J， Sanchez J L， Roman G ， et al.Seasonal changes in lipid classes and fatty acid composition in the digestive gland of Pecten maximus [J].Comp Biochem Phys B， 2003， 134： 367-380

    [26] Cook E J， Bell M V， Black K D， et al.Fatty acid compositions of gonadal material and diets of the sea urchin， Psammechinus miliaris： trophic and nutritional implications [J].J Exp Mar Biol Ecol， 2000， 255（2）： 261-274

    （收稿日期：2016-12-29）