嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药性获得与消失速率

    王小亮　贾丽　王静波　王姝　曹欢　张文　徐立蒲

    摘要：为摸清淡水鱼类最主要的致病菌——嗜水气单胞菌对国家批准使用的新兽药——氟苯尼考的耐药性的获得与消失速率，提供科学使用该药的数据支撑，测定在低浓度的氟苯尼考压力下，3株嗜水气单胞菌对氟苯尼考的最小抑菌浓度（MIC）随时间的变化，以及3株菌对氟苯尼考的耐药性获得速率和消失速率。结果表明，菌株在低浓度的氟苯尼考下，4～5 d其耐药浓度升高1.6～2.5倍。同时，菌株对氟苯尼考的耐药浓度随着药物浓度的逐渐增加可迅速上升15.9～40倍，但其消失较慢，28 d的消失速率为1.58～2.54。因此， 在使用氟苯尼考防治细菌性疾病时，连用时间不宜超过4 d，再次使用的间隔不少于28 d。

    关键词：嗜水气单胞菌；氟苯尼考；耐药性

    中图分类号：S948

    文献标识码：A

    当前，防治嗜水气单胞菌性疾病的主要手段是使用化学药物[1]。然而，我国对鱼类的抗菌药物的药效学及药物代谢动力学等基础研究的薄弱，加上养殖者轻预防重治疗，不针对病原的盲目用药和未进行药敏实验的滥用鱼药，导致嗜水气单胞菌耐受的抗菌药物种类日益增多，对抗菌药物的耐受剂量越来越强。目前，嗜水气单胞菌对上世纪60年代开始使用的磺胺类药物敏感率不足20%[2]，对上世纪80年代开始使用的喹诺酮类药物的敏感率已从100%下降到40%～60%[3]。

    氟苯尼考又称氟甲砜霉素，是一种新型的动物专用的氯霉素类广谱抗生素。20世纪80年代末研制而成，1990年在日本首先用于水产养殖业，之后在世界范围内广泛上市。我国于1999年批准氟苯尼考为国家二类新兽药，最早用于水产养殖上治疗鳗鲡爱德华氏菌病和赤鳞病[4]，目前，已在水产业广泛应用，主要用于防治鱼类的各种细菌性疾病。为避免氟苯尼考重蹈磺胺类药物和喹诺酮类药物的覆辙，本文开展嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药性获得和消失速率研究，为科学规范氟苯尼考的使用提供依据。

    1材料和方法

    1.1材料

    3株嗜水气单胞菌菌株为2013年5月从北京怀柔发病的养殖鲟鱼上分离获得，纯化后经API鉴定系统和16S rDNA鉴定为嗜水气单胞菌，分离部位分别为肝、脾、肾，编号1、2、3。Mulluer-Hinton肉汤（MHB）购于北京陆桥技术有限责任公司，脑心浸液琼脂（BHIA）购于英国OXOID公司。氟苯尼考购于美国Sigma公司，用甲醇溶解后，用蒸馏水稀释，制备浓度为2 560 μg/mL，经0.2 μm滤膜过滤除菌后，作为母液备用。

    1.2方法

    1.2.1菌株最小抑菌浓度的测定采用临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的浓度稀释法（NCCLS，2010）。操作方法为：菌株接种至BHIA平板，置于28 ℃培养16～20 h后，采用045%无菌生理盐水制成0.5麦氏浊度菌悬液，稀释100倍备用。使用母液和无菌MHB培养基制备氟苯尼考浓度梯度，浓度分别为0.5 μg/mL、0.8 μg/mL、1.3 μg/mL、2.0 μg/mL、3.2 μg/mL、5.0 μg/mL、8.0 μg/mL、12.7 μg/mL、20.2 μg/mL、32.0 μg/mL，每管3.0 mL，每管加备用的菌悬液100 μL，无菌塞封口后于28 ℃培养48 h，记录最小抑菌浓度（MIC）。

    1.2.2一定氟苯尼考浓度压力下菌株MIC随时间的变化制备氟苯尼考浓度为0.4 μg/mL灭菌MHB培养基，灭菌试管分装成5 mL/管。每株菌接种9支试管，每管接种100 μL备用菌悬液。加灭菌塞子，置于28 ℃生化培养箱中孵育，每天早、中、晚对试管摇匀。每天取一管，按1.2.1方法测定菌株的MIC值。

    1.2.3菌株对氟苯尼考的耐药性获得速率测定菌株的MIC后，从肉眼观察有细菌生长的最高药物浓度的试管中吸取100 μL培养基，将其接种在不同氟苯尼考濃度的MHB培养基试管中，28 ℃孵育48 h；再从肉眼观察有细菌生长的最高药物浓度的试管中吸取100 μL培养基，接种至不同氟苯尼考浓度的MHB培养基试管中，28 ℃孵育48 h。连续操作7次。使嗜水气单胞菌在含有氟苯尼考的药物培养基中传代7次，比较最后测定的MIC与最初的MIC比较，评价菌株对氟苯尼考的耐药性获得速率。

    1.2.4菌株对氟苯尼考的耐药性消失速率将1.2.3选出的已获得较高耐药性的菌株，以琼脂内穿刺法将菌株分别接种在盛有不含氟苯尼考的BHIA培养基中，在4 ℃条件下保存，测定放置1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d后，菌株的MIC值。同时，采用不含氟苯尼考的BHIA平板传代，连续传代7次，测定每次传代后菌株的MIC值。将菌株4 ℃放置28 d的MIC值及传代7次后测定的MIC与最初的MIC比较，评价菌株对氟苯尼考耐药性消除速率。

    2结果

    2.1一定浓度的氟苯尼考压力下菌株MIC随时间的变化规律

    在一定浓度的氟苯尼考压力下，氟苯尼考对3株嗜水气单胞菌的MIC均呈现先逐步上升之后稳定的趋势。经0.4 μg/mL的氟苯尼考作用4～5 d，嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药浓度升高2.0～2.5倍。见表1。

    2.2菌株对氟苯尼考的耐药性获得速率

    3株嗜水气单胞菌经连续7次在带有氟苯尼考的培养基中传代培养，菌株对氟苯尼考的耐药性变化情况见表2。由表2可以看出3株嗜水气单胞菌在含有氟苯尼考的培养基中传代7次后，均获得了较强的耐药性。3株嗜水气单胞菌的MIC分别从0.8 μg/mL上升到了12.7 μg/mL、32.0 μg/mL和20.2 μg/mL，分别上升了15.9倍、40.0倍和25.3倍。

    嗜水气单胞菌对氟苯尼考的MIC随放置时间和传代次数的变化数据分别见表3、表4。数据表明，菌株对氟苯尼考的MIC值随放置时间和传代次数逐渐降低，表明菌株的耐药性在逐渐消失。菌株放置28 d，MIC值分别由12.7 μg/mL、32.0 μg/mL、20.2 μg/mL下降至5.0 μg/mL、12.7 μg/mL、8.0 μg/mL。菌株传代7次，MIC值分别下降至5.0 μg/mL、20.2 μg/mL、8.0 μg/mL。菌株对氟苯尼考的耐药性消失速率在1.58～254之间。

    本文实验了低浓度的氟苯尼考压力下的嗜水气单胞菌耐药性变化以及菌株对氟苯尼考的耐药性获得速率和消失速率。在低浓度的氟苯尼考作用下4～5 d即可导致菌株的耐药浓度升高1.6～2.5倍。这与Pallares等[5]发现低浓度的抗菌药物与细菌长期接触会导致菌株产生耐药性和治疗失败观点基本一致。同时，菌株对氟苯尼考的耐药浓度随着药物浓度的增加，7次即可上升15.9～40.0倍。氟苯尼考是浓度依赖型药物，宜每日用药1次。以上信息提示我们使用氟苯尼考治疗疾病时，使用剂量需要用到杀菌浓度，使用时间不宜超过4 d，不然会导致菌株产生耐药突变，疾病更难治疗。在使用剂量如何用到杀菌浓度方面，李梦影等[6]通过对氟苯尼考在鲫和草鱼体内的药代/药效动力学联合参数及临床给药方案的研究，建议氟苯尼考的给药剂量为30 mg/kg。陈昌福教授依据日本学者研究的鱼类病原菌的MIC与使用剂量的关系，建议给药剂量为鲤科病鱼分离菌的MIC乘以8.1。无论何种给药剂量，只有充分了解病原菌的药物感受性水平、药物在鱼体的药代动力学特性，完美结合两者才能达到精准药效。

    嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药性消失速率较慢，28 d的下降速率为1.58～2.54。显然，菌株一旦获得较高的耐药水平，自然恢复最初的耐药水平则至少需要28 d。因此，为避免耐药菌株产生，延长药物使用年限，两次使用氟苯尼考的时间间隔至少在28 d以上才更为科学。

    参考文献：

    [1]

    李爱华.水产养殖中使用的抗菌药物及细菌耐药性[J].中国水产科学，2002，9（1）：87-91

    [2] 王小亮，徐立蒲，王静波，等.北京市主要养殖鱼类病原菌药物敏感性分析[J].北京农业，2012，（36）：79-81

    [3] 王小亮，徐立蒲，曹欢，等.鱼源病原菌对氟喹诺酮类药物的耐药性分析[J].中国畜牧兽医，2013，40（3）：195-199

    [4] 张雷，张骊，徐倩，等.氟苯尼考的毒性及残留检测方法研究进展[J].中国兽药杂志，2009，43（6）：49-52

    [5] Pallares R，Fenoll A，Linares J.The epidemiology of antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae and the clinical relevance of resistance to cephalosporins，macrolides and quinolones[J].International Journal of antimicrobial agents，2003，（22）：12-24

    [6] 李夢影，徐丽娟，吕利群.氟苯尼考在鲫和草鱼体内的药代/药效动力学联合参数及其临床给药方案的研究[J].水产学报，2014，38（6）：888-894

    （收稿日期：2016-11-11）