两株芽孢杆菌的生长特性及其对仿刺参的益生作用
姜冰
摘要：本实验室前期从大连湾地区健康的仿刺参养殖池塘沉积物中分离出两株芽孢杆菌即B6和B7。首先，通过分析二者的生长特性发现，B6和B7的最适生长温度为15～35 ℃；最适pH范围为6～8；最适盐度为3%～5%。 菌株产酶特性检测结果表明，B6和B7均可产生淀粉酶和蛋白酶， B7产脂肪酶。将两种菌悬液投喂仿刺参后发现，B6和B7可有效提高仿刺參肠道内的消化酶活性以及体腔液中多种非特异性免疫酶活性。本研究结果表明：B6和B7可作为益生菌剂的基础菌株添加至仿刺参生长环境中，并且对仿刺参的消化及免疫功能具有正向刺激作用。
关键词：芽孢杆菌；仿刺参；消化酶；非特异性免疫酶活性
仿刺参（Apostichopus japonicus）营养丰富，具有较高的药用及食用价值，是目前我国辽宁沿海养殖范围最广的经济品种之一[1-2]。近年来，养殖规模逐渐扩张，养殖密度过高，仿刺参相关病害问题日趋凸显，极大制约了其养殖产业的持续、健康、稳定的发展[3]。近年来，益生菌在水产养殖中的应用越来越多。益生菌的应用抑制病原，激活免疫，从而减少疾病的发生；益生菌可以作为补充营养成分，促进生长。在水产养殖中推广使用益生菌，有利于保障辽宁水产养殖业的健康持续发展[4]。
芽孢杆菌，是具有芽孢的好氧革兰氏阳性菌，具有耐酸、耐盐、耐高温和可分泌多种能降解有机物的酶类（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）等特点，有助动物对饲料的消化，增强动物的免疫力，因此现今常将其作为一种益生菌剂添加至动物饲料以及养殖环境中[5-6]。Kozasa等[7]将从土壤中分离的芽孢杆菌投喂鳗鲡，发现该菌可有效提高鳗鲡对弧菌的抵抗能力，增强其抗病性；除此之外，袁丰华等[8]在尖吻鲈饲料中添加不同量的凝结芽孢杆菌，发现该菌对尖吻鲈的生长有一定的促进作用，并可以影响其肝蛋白酶和胃淀粉酶的活性。目前应用于水产养殖领域中的益生芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等，且在鱼虾养殖中的应用较为常见，在仿刺参养殖过程中却少有报道，更多研究亟待深入[9]。本实验室前期自大连地区健康仿刺参养殖池塘底泥中筛选并鉴定到两株芽孢杆菌，分别命名为B6和B7，通过分析二者的生长特性，产酶特性以及对仿刺参消化酶和非特异性免疫酶活性的影响，探讨二者作为仿刺参益生菌种资源的可行性，为芽孢杆菌在仿刺参养殖过程中的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1菌种本研究中使用的芽孢杆菌株B6和B7，来自辽宁省海洋水产科学研究院菌种保藏室，从大连湾地区的健康仿刺参养殖池塘底泥中分离得到。
1.1.2培养基
2216E固体以及液体培养基：采购于青岛海博生物科技有限公司；
LB培养基：酵母粉 5 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 10 g，NaOH调pH至7.0，121 ℃、20 min高压灭菌。
淀粉琼脂培养基（W/L）：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，淀粉5 g，琼脂15 g，NaCl 10 g，1 000 mL纯净水，于121 ℃灭菌20 min后，均匀倒入平板中备用。
脱脂牛奶培养基（W/L）：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，脱脂奶粉 5 g，酵母粉5 g，琼脂15 g，1 000 mL蒸馏水，于121 ℃灭菌20 min后，均匀倒入平板中备用。
罗丹明B橄榄油琼脂培养基（W/L）：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，琼脂15 g，NaCl 10 g，1 000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20 min，向灭菌后培养基中加入31.25 mL橄榄油和10 mL罗丹明B溶液（ 1 g /L），经磁力搅拌器剧烈搅拌后，静置几分钟，均匀倒入平板中备用。
1.1.3实验仪器酶标仪，洁净工作台，恒温培养箱，恒温培养摇床，荧光显微镜，离心机。
1.2实验方法
1.2.1菌株的生长特性分析将B6和B7菌株进行活化后，分别按照5%的接种量转接至100 mL的LB培养基中，不同温度、盐度和pH条件下对其进行震荡培养，每隔三小时取一次样，利用分光光度计测定菌液在660 nm处的吸光度值，并绘制菌株的生长曲线。实验温度设定为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃五个梯度，盐度设定为30‰、50‰、75‰、100‰和125‰五个梯度，pH设定为6、6.5、7、8和9五个梯度。
1.2.2菌株的产酶特性分析通过卢革氏碘液法测定考察菌株产淀粉酶特性；通过脱脂牛奶法考察菌株的产蛋白酶特性；通过罗丹明B橄榄油法考察菌株产脂肪酶特性[10]。
1.2.3实验设计与管理试验于辽宁省海洋水产科学研究院苗室进行。选取规格相近（约13 g）、生长环境相似的健康仿刺参，在实验室暂养一周后，分别饲养于装有50 L水体的蓝色水槽中，每个水槽中10头， 4个水槽为一组，其中一组加入芽孢杆菌B6，一组加入芽孢杆菌B7，另外一组作空白对照。试验阶段水温为15±1 ℃，期间连续充气。试验组，按仿刺参体质量的5%投饵并投入终密度为108 cfu/L的菌悬液；对照组只投饵不投喂菌液，每组2个重复。实验时间设定为28 d。每7 d取样一次，从实验组和对照组中随机抽取5头仿刺参，充分消毒后，解剖并取其体腔液上清和肠道，置于-80 ℃冷冻保藏待测。
1.2.4仿刺参肠道消化酶的测定选取仿刺参肠道脂肪酶、淀粉酶以及蛋白酶作为消化酶的评价标准。将仿刺参肠道样品从-80 ℃ 冰箱中取出，于冰上解冻。称取相同重量肠道样品置于手动匀浆器中，加入9 倍体积的0.9%氯化钠溶液，冰浴匀浆。匀浆后的样品液置于离心管中，4 000 r /min，离心10 min，取上清液待测。
采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测仿刺参肠道蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶活性，具体测定方法参照产品说明书。
1.2.5仿刺参非特异性免疫酶活性测定仿刺参的非特异性免疫酶选取4个指标作为评价标准，包括：总超氧化物歧化酶活性（T-SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、酚氧化酶活性（PO）的活性。
采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测仿刺参体腔总超氧化物歧化酶活性（T-SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性，具体测定方法参照产品说明书。其中酚氧化酶的检测采用多巴络合物生成法[11]。
2实验结果
2.1菌株生长特性
菌株的生长随温度、盐度、pH变化曲线如图1所示。由图1可知，菌株B6和B7在15～35 ℃范围内均可生长，且长势良好；二者生长所需的最适pH范围较为宽泛，菌株B6在pH为6.0～9.0范围内生长较快，于6 h后进入指数增长期，18 h后进入稳定期；菌株B7在pH为6.0～8.0范围内生长较快，而在pH为9时生长相对缓慢，于24 h时才进入指数增长期，由此得出，二者生长最适pH范围为6.0～8.0；除此之外，菌株B6在盐度为30‰～50‰时生长较快，在12 h后进入指数增长期，而菌株B7在盐度为30‰～75‰范围内生长较快，于6 h后便进入指数增长期。
2.2菌株的产酶特性
将芽孢杆菌株B6、B7点种于不同的产酶特征琼脂平皿，培养48 h后观察结果。结果显示：在淀粉琼脂培养基上，加入卢革氏碘液后，B6、B7菌落周围变色，说明两菌株均可产淀粉酶；在脱脂奶粉琼脂培养基培养后，两株菌株的周围产生透明水圈，说明二菌株都可产蛋白酶；但在罗丹明B琼脂培养基上在紫外线照射下，B7菌株周围看到橙色光圈，说明该菌株自身可产生脂肪酶，而在B6菌株周围未发现橙黄色荧光圈，说明B6菌株未产生脂肪酶。
2.3菌株对仿刺参肠道消化酶的影响
如图3所示，菌株B6和B7可以有效提高仿刺参体内多种消化酶的活性，其中B6和B7菌株对仿刺参体肠道内脂肪酶的活性影响较大，而对淀粉酶的并没有显著的刺激作用，而B6菌株对蛋白酶的作用效果优于B7菌株，由此初步推断，益生菌株对仿刺参体内酶活的影响可能具有相对特异性。
2.4菌株对仿刺参体腔非特异性免疫酶的影响
如图4所示，菌株B6和B7对仿刺参体腔液中的ACP、AKP、T-SOD和PO的活性均有显著性的影响，尤其是两种处理样品中ACP的活性明显高于对照组。而菌株B7对AKP、T-SOD以及PO的影响均较B6菌株显著。从图中可以看出菌株的投喂对仿刺参的免疫刺激作用均有正向刺激，且B7菌株作用效果优于B6。
3讨论
微生物生长需要在特定的温度、盐度和pH范围内，因而明确菌株的生长特性也是菌株应用的前提和基础。仿刺参作为一种重要的养殖品种，其生长最适温度往往不得高于23 ℃，最适盐度为3%，最适pH范围为7.9～8.4，在此范围内仿刺参长势良好。据此，在筛选对刺参具有益生作用的菌株时，首先应选用生长条件与仿刺参接近的益生菌。通过分析B6和B7的生长特性发现，二者生长所需的条件较为宽泛，最适温度为15～35 ℃，最适pH范围为6～8，最适盐度为3%～5%，因此两株菌株可以作为候选益生菌，进行后续试验。
芽孢杆菌作为水生益生菌剂中常用的菌种，在其发酵过程中可产生许多胞外酶如蛋白酶和淀粉酶等[12-13]，因而当把该菌株添加至饲料中可有效提高动物的生产性能。本实验结果表明：B6和B7均可以产蛋白酶和淀粉酶，且B7自身可产生脂肪酶，因此两株菌株具有潜在的益生作用。除此之外，将B6和B7菌株添加至仿刺参饲料中发现，二者可提高仿刺参肠道内蛋白酶和脂肪酶的活性，然而对于淀粉酶的活性并没有显著影响，尤其是B7菌株虽自身可产生淀粉酶，却未能有效增强仿刺参体内该酶的活性。因此，关于B6和B7菌株对于仿刺参肠道内消化酶的影响机制还有待于进一步研究。
除了消化酶之外，本研究发现两种芽孢杆菌可以提高刺参体腔液中的多种免疫酶活性。酸性磷酸酶（ACP）是巨噬细胞内溶酶体标志酶，是溶酶体的重要组成部分，主要参与吞噬水解机体内的异物[14]；碱性磷酸酶（AKP）是生物体内的一种重要的调控酶，在碱性环境下可催化磷酸单酯水解，参与蛋白质的合成等，也是溶酶体酶的重要组成部分[15-16]；总超氧化物歧化酶（T-SOD）能够有效清除机体代谢过程所产生的超氧根阴离子，与生物的免疫水平密切相关，其活性变化可以作为反映某些海洋生物的机能健康状况及衡量其免疫状态的指标[17]；酚氧化酶（PO）是无脊椎动物的免疫防御中的重要免疫酶，它往往以无活性的免疫酶原形式存在，可将酚催化形成黑色素，而黑色素及中间产物具有抗微生物的活性，所以酚氧化酶对于维持动物体液的无菌性十分重要[18]。综上可见，上述几种酶均可以作为评价动物免疫能力的重要指标。本研究结果表明，菌株B6和B7对仿刺参体腔液中的ACP、AKP、T-SOD和PO的活性均可产生正向的刺激作用，尤其是对ACP酶活性的影响最为显著，该结论与近期许多研究结果相符合。朱学芝[19]等用枯草芽孢杆菌投喂凡纳滨对虾后，发现虾血中的ACP和AKP的活性显著升高；骆艺文[20]用添加了0.1%的复合芽孢杆菌制剂的饵料投喂仿刺参后，发现仿刺参体腔液中的AKP、ACP、T-SOD和PO活性显著高于对照组，以上结果均与本研究得出的结论相符合。综上所述，将芽孢杆菌B6和B7作为益生菌剂的基础菌株添加至刺参饲料中具有可行性，二者可在一定程度上提高刺参体内的消化酶及免疫酶活性，更好地增强仿刺参的消化和抗病能力。
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