犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析
师丽敏 夏冬华 程台格
摘要：使用Vero细胞接种临床症状疑似感染犬流感病毒（CIV）的犬肺组织，盲传3代，观察其病变情况，收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性及形态学观察，同时进行序列测定和分析，并制作系统进化树。结果表明，从犬肺中成功分离出一株犬流感病毒，该病毒能够凝聚豚鼠、猪、鸡抗凝血，电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明，与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒基因同源性极高，只有少数地方發生了特异变异。这些数据的分析对于犬流感的防控有一定的参考价值。
关键词：犬流感病毒;分离鉴定;基因序列
中图分类号：S858.292 ? ? ? ?文献标识码：A ? ? ? ?文章编号：1007-273X（2019）08-0009-02
犬流感是由犬流感病毒（CIV）引起的犬的一种接触性传染病，该病的主要临床症状表现为发热、流涕和咳嗽。CIV是犬传染性呼吸系统疾病的主要病原之一，其容易引起犬的支气管炎和支气管肺炎，损害呼吸道上皮细胞，给其他病原体的感染创造了条件。该病对于世界各国养犬业的发展也产生了一定的影响。
CIV在分类上属于副黏病毒科副黏病毒亚科如布拉病毒属。其与同属的猴病毒V型、人SV5分离株及人流感病毒等抗原性密切相关。当前，市场上虽然有相关疫苗，但是该病的发生率依然很高，之所以出现这种现象可能与该病毒的不断变异存在一定的关系。基于该原因，分离当前的流行变异株、了解序列变异情况对于该病的预防、诊断及治疗意义重大。本试验对一例疑似犬流感病例的肺组织中分离出的病毒进行了鉴定，并尝试对该病毒中的部分基因序列进行了分析，探讨了其出现遗传变异的情况。现将其报道如下。
1 ?材料与方法
1.1 ?材料
本研究选取临床诊断为犬流感的病死京巴犬1只，其年龄约1岁左右，临床表现为患犬精神萎靡不振、不喜进食、咳嗽、流涕、喘息等呼吸道症状，同时还伴有发热等不良症状。最终该犬治疗无效死亡，将病犬的肺脏取出进行处理[1]。
细胞系：Vero细胞购于海南壹田生物科技有限公司，并用于后期的分离鉴定和部分基因序列分析。
1.2 ?病毒分离
参照已有的分离方法对病毒进行分离，并将成功分离的病毒命名为QF20180726。
1.3 ?病毒鉴定
血凝试验：分别采集豚鼠、鸡、猪抗凝血，使用PBS液洗涤红细胞四次，1 500 r/min离心10 min，用PBS液配成1%红细胞悬液进行血凝试验。然后对细胞培养液负染色，进行电镜观察[1]。
2 ?结果与分析
2.1 ?病毒分离培养
病料接种到Vero细胞第五代24 h后出现典型细胞病变，截止到第5天收毒的时候，大部分细胞融合、裂解死亡，培养液中碎片增多，相同条件下的正常细胞没有出现这种变化。
2.2 ?血凝试验
病毒在25 ℃的环境下能够凝集豚鼠、猪、鸡红细胞。
2.3 ?RT-PCR鉴定结果
对Vero细胞培养病毒进行犬流感病毒的RT-PCR检测，最终结果显示，Vero细胞培养的病毒为CIV阳性。
2.4 ?电镜观察
电镜片显示，CIV为圆形，有囊膜，其直径为80 mm左右，囊膜上有直径8～10 nm的纤突。病毒因囊膜破损而呈现出不规则的形态，成多形性、长丝状等。
2.5 ?N基因序列同源性分析
与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒N基因相比较，核苷酸同源性为95.7%～99.8%，氨基酸同源性为97.4%～99.6%。有两处氨基酸发生了新的变异，分别是第257位由V变成了A，第301位由A变成了T。其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低，为97.4%，与犬源流感病毒分离株08-1990和D277同源性最高，均为99.6%。
2.6 ?F基因序列同源性分析
与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒F基因相比较。核苷酸同源性为94.7%～99.6%，氨基酸同源性为95.6%～99.3%。有两处发生特异变异，其分别是第56位由T转变为S，第89位由T转变为M。其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低，为95.6%，与犬源流感病毒分离株08-1990同源性最高，为99.3%。
2.7 ?HN基因序列同源性分析
与人源、犬源等10株具有代表性的流感病毒HN基因相比较，核苷酸同源性为95.5%～99.8%，氨基酸同源性为96.3%～99.6%，其中与人流感病毒分离株LN同源性最低，为96.3%，与犬源流感病毒分离株D277同源性最高，为99.6%。
2.8 ?N、HN和F基因克隆、测序
使用设计的N、F和HN基因引物扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳，分别可以见到约1 680、1 970和1 830 bp左右的3个基因片段，其大小与N、F和HN蛋白基因类似，预测结果证实本试验所克隆的基因是正确的，这也从侧面说明本次研究是有效的。
3 ?小结与讨论
本研究在对该病进行分析时，已经建立起了病毒分离、血凝、血凝抑制监测方法以及RT-PCR方法，但是这些方法对实验条件的要求相对比较高，而且所需要的时间也比较长，其推广难度相对来说比较大。而分离鉴定及部分基因序列分析则是一种简单、快速、准确的基因测试法。本研究对CIV检测的反应条件进行了优化，提高了犬流感病毒分离鉴定及部分基因序列分析的特异性和灵敏度，该技术基本上克服了当前临床和实验室诊断CIV方面存在的不足，其操作条件简单方便，在对病毒进行分析和测试时，不需要太过复杂的仪器设备、分离成本比较低，为相关疾病的诊断和治疗提供了较大的便利。
犬流感是一种可以在成年犬间快速传播、引起犬呼吸系统不畅的疾病，该病在比较严重的情况下会造成犬只死亡。据相关研究表明之所以会出现犬流感病毒，是因为这些流感病毒来源于异种动物。流感病毒与其他病毒不同，其可以突破种间屏障，感染异种动物，犬作为宠物与人接触密切，因此对该病必须要引起足够的重视。本试验之所以开展分离鉴定及部分基因序列分析，就是为了建立一种行之有效的CIV检测方法，其对于开展CIV的综合防治与疾病诊断有着极为重要的意义。
据血清学调查表明，CIV在世界各地普遍存在，是危害犬业发展的主要传染病之一，该病毒在所有的犬类中都有流行，对于已经患病的犬来说，还可能会引发其他的并发症，如急性脑脊髓炎、脑内积水等，该病的出现严重危害了犬类的健康生长。近些年来，随着我国养犬业的不断扩大，CIV也受到了越来越多人的重视[2]。
本试验以海口某动物医院诊治的1例临床诊断疑似CIV感染京巴犬作为对象，发现其在患病之后的主要临床症状表现为精神萎靡不振、不喜进食、咳嗽、流鼻涕、喘息声粗重等呼吸道症状，同时还伴有发热等不良症状，因治疗无效而死亡。一般情况下，犬单独感染CIV的情况并不多见，在对死亡病犬解剖检查时，发现病犬的死亡可能与细菌、支原体和病毒等混合感染有一定的关系。为了更加深入分析CIV变异情况，本试验从患犬肺组织中分离得到了一株CIV，并结合实验室检测手段对其中的部分基因序列进行了分析，详细研究了基因变异情况。结果表明该病毒能够在4 ℃条件下将豚鼠、猪、鸡等凝聚到一起，这一特性与CIV的血凝特性基本上是一致的。在电镜下观察病毒株结构时，发现其超微结构呈圆形、长丝状等不规则形态。
通过对N、HN和F基因进行扩增和测序，其核苷酸和氨基酸同源性分析和系统进化关系显示，与10株有代表性的犬流感病毒N基因核苷酸的同源性为95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%，其中有两处氨基酸发生了全新的变异：第257位由V变成了A，第301位由A变成了T;其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低，为97.4%，与犬源流感病毒分离株08-1990和D277同源性最高，均为99.6%。HN基因分析显示，与10株有代表性的流感病毒HN基因核苷酸同源性为95.5%～99.8%，氨基酸同源性为96.3%～99.6%;其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低，为96.3%，与犬源流感病毒分离株D277同源性最高，为99.6%。与10株有代表性的流感病毒F基因核苷酸同源性为94.7%～99.6%，氨基酸同源性为95.6%～99.3%[3]。有两处发生特异变异，分别是56位由T变成S，89位由T变成了M。其中与人源流感病毒分离株LN同源性最低，为95.6%，与犬源流感病毒分离株08-1990同源性最高，为99.3%。F基因的遗传变异对于CIV的预防有着极为重要的影响，特别是重要抗原位点的变化，其可能会导致疫苗的免疫保护不够全面，本次分离株F基因的变异是否能导致疫苗的免疫保护不全或者是增加CIV的毒力变化值则还需要进一步深入研究和分析。N、HN和F基因序列分析还表明，犬流感病毒流行毒株之间氨基酸序列变化并不是很大，但与其他毒株之间的差异相对来说是比较大的。
4 ?结论
本试验成功分离出一株犬流感病毒，该病毒在25 ℃条件下可以成功吸附豚鼠、鸡、猪血红细胞。电镜观察显示病毒为圆形、长丝状等形态多样、大小不等的病毒粒子。结合N、HN和F基因序列分析显示，成功分离的犬流感病毒株与犬流感病毒分离株08-1990的亲缘关系是最近的，同时由于病毒感染，其基因序列发生了特异性变异。
参考文献：
[1] 罗思思，谢芝勋，谢丽基，等.H7亚型和N9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立[J].畜牧兽医学报，2015（7）：1176-1183.
[2] 陈 ?樱，莫彦宁，周华波，等.类人H3N2犬流感病毒广西分离株的鉴定及其遗传演化分析[J].中国预防兽医学报，2015（5）：401-404.
[3] 于志君，朱晓文，刘 ?红，等.A型流感病毒跨种传播和致病性相关蛋白研究进展[J].动物医学进展，2011（11）：90-94.
