氯氰菊酯和吡虫啉对克氏原螯虾AchE和Na+—K+—ATPase活性的影响

    摘 要：乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物体内，在神经传导中起着重要的作用的水解酶。研究发现，暴露于亚致死浓度的杀虫剂AChE会被严重抑制，因此这种酶常用来作为评价环境污染的生物标志物；Na+-K+-ATPase则几乎存在于所有动物的细胞膜上，是横跨质膜的一种重要酶类，其维护的离子梯度具有重要的生理意义。水体中污染物如农药、工业品多氯联笨等物质对许多水生无脊椎动物Na+-K+-ATPase有着不同程度的抑制作用。为此，本试验研究了克氏原螯虾暴露于亚致死浓度氯氰菊酯和吡虫啉后AChE和Na+-K+-ATPase的活性变化，为选用生物标志物或早期预警系统监测环境中的有关农药以及评估这两种农药对养殖优势种克氏原螯虾的危害性提供依据。

    关键词：氯氰菊酯；吡虫啉；克氏原螯虾

    1 材料和方法

    1.1 试验用虾

    实验用虾采于鄱阳湖南矶山水域，体长8±0.474cm，体重13±2.669g，试验前在水箱中暂养7-10天，所用水为充分曝气的自来水，试验时选择无病伤，个体健壮，活力强的虾。

    1.2 试剂及仪器

    722分光光度计，电子分析天平，玻璃匀浆器，恒温水浴锅，TGL-16A台式高速冷冻离心机，烘箱，冰箱等。试剂盒均采购于南京建成生物研究所，具体操作按试剂盒说明书进行。

    1.3 驯养

    实验用虾在实验前驯养于塑料水族箱中，试验用水为去氯自来水，不间断充气，水温13.77±1.77℃，pH值6.71±0.17，溶解氧（DO）为7.13±0.51，每日换水并投放饲料。一周后开始正式实验，实验前24h停止喂食，试验期间不再喂食。

    1.4 实验设计

    按实验得到的克氏原螯虾氯氰菊酯96hLC50（0.06mg/L）将胁迫浓度设为0-0.060mg/L范围内的6个浓度，分别是0，0.012，0.024，0.036，0.048和0.060mg/L。同样地根据吡虫啉96hLC50（10.98mg/L）将吡虫啉溶液设为6个浓度，分别为0，2.2，4.4，6.6，8.8和10.98mg/L。每个水族箱随机挑选10只健康活泼的克氏原螯虾，胁迫实验持续进行24h，实验期间不间断充气。

    1.5 样品制备

    实验结束后，从实验组和对照组分别随机取出5尾克氏原螯虾，冲洗后擦干、称重、在冰块上快速解剖取出适量鳃组织，剔除附着物，用滤纸吸干表面水分，电子天平称重后，将所取样品按其重量分别加入10倍 （w：v）的预冷重蒸水，在-4℃下用研磨成匀浆，取匀浆液用高速冷冻离心机离心（0-4℃，l0000r/min，30min），取上清液作为待测样液进行酶活性测定，置于4℃冰箱中备用，放置时间不超过24h。

    1.6 酶活测定

    AChE活性试剂盒采用巯基显色法，其定义为：每毫克组织蛋白在37℃保温6分钟，水解反应体系中1umol基质为1个活力单位（U/mgprot）。

    蛋白含量采用Bradford法测定，以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白，单位：g/L。

    2 结果与讨论

    2.1 氯氰菊酯对克氏原螯虾鳃AChE和Na+-K+-ATPase活性的影响

    2.1.1氯氰菊酯对克氏原螯虾鳃AChE活性的影响

    氯氰菊酯胁迫下，克氏原螯虾乙酰胆碱酯酶活力变化情况见图1。从图中可以看出，受试虾乙酰胆碱酯酶活力变化随着氯氰菊酯浓度的升高，其活力呈现先上升后下降的趋势。在0.012mg/L组其活力达到最大，呈现出诱导作用，酶活性较对照组上升了93.8%；0.06mg/L组活性最低，显示出一定的抑制作用，酶活性降至空白对照组的69.0%， 0.012mg/L处理组和对照组、0.048mg/L、0.060mg/L组间具有显著性差异（P<0.05）。但除此外，其它处理组和空白对照组之间活性均不具有显著性差异（P>0.05）。

    2.1.2氯氰菊酯对克氏原螯虾鳃Na+-K+-ATPase活性的影响

    从上图可以看出克氏原螯虾在亚致死浓度氯氰菊酯胁迫下，其Na+-K+-ATPase的活性变化。随着暴露浓度的增加， Na+-K+-ATPase活性逐渐下降， 在最高浓度0.06mg/L组，其活性降至最低，仅为空白对照组的27.7%，其它各组的活性分别为空白对照组的64.6%，48.9% 、31.2% 、29.5%，但各处理组及对照组间的活性均无显著性差异（P>0.05）

    2.1.3讨论

    大量的研究结果表明，环境中的许多有毒物质（农药、重金属离子、燃油及工业废水等），均可能抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）和Na+-K+-ATPase。刘晓宇等报道了敌敌畏、辛硫磷和乐果对鲟鱼脑乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用；Galgani等在研究北海大范围水域中比目鱼组织中乙酰胆碱酯酶活性中发现，随着水域中污染的梯度变化，乙酰胆碱酯酶活性也随之发生变化；谢卓丘报道溴氰菊酯对大鼠脑AChE的活性无抑制作用，同时周志刚等也认为溴氰菊酯对草鱼无显著影响，但Bendahou N报道溴氰菊酯对蜜蜂AChE活性却具有显著降低的作用，商利新在实验中也得出结论，氯氰菊酯对日本沼虾乙酰胆碱酯酶（AChE）和Na+-K+-ATPase有明显的抑制作用。可见随着不同物种体内的代谢速度、解毒酶活力以及乙酰胆碱酯酶敏感程度不同，它们的耐毒能力大不相同，相同毒物对于不同生物表现出不同的毒性作用。本实验中结果表明，亚致死浓度的氯氰菊酯胁迫下，受试虾乙酰胆碱酯酶活力不仅没有被抑制，反而被诱导，活力相对增强，在氯氰菊酯浓度达到0.036mg/L胁迫时，乙酰胆碱酯酶活力出现下降，但与对照组无显著差异，可见于亚致死浓度氯氰菊酯对克氏原螯虾乙酰胆碱酯酶的毒害作用不是很明显，但对Na+-K+-ATPase活性的影响的比较显著，随着胁迫浓度的升高，其活性不断地下降，表现出一定的剂量-效应关系。说明氯氰菊酯损害了其细胞膜功能，影响受试虾的水盐代谢的调节，这与其它报道的结果基本上是一致的。由此可见，低浓度的氯氰菊酯对其神经毒害的作用不明显，不会抑制受试虾的乙酰胆碱酯酶活性，但对细胞膜有较明显的毒性作用，一旦胁迫浓度再升高，必将会导致螯虾大量死亡。

    2.2 吡虫啉对克氏原螯虾鳃AchE和Na+-K+-ATPase活性的影响

    2.2.1吡虫啉对克氏原螯虾鳃AchE活性的影响

    图3说明了克氏原螯虾随着吡虫啉胁迫浓度的增大，其乙酰胆碱酯酶活力的变化情况。从图中可以得知，受试虾乙酰胆碱酯酶活力变化与在氯氰菊酯胁迫下所表现出的变化非常相似，也是先上升后下降的趋势。在2.2mg/L组其活力达到最大，酶活性高出空白对照组59.8%，其诱导作用达到显著水平（P<0.05），4.4mg/L处理组活性仅低于2.2mg/L处理组，活性高出对照组54.1%，诱导作用也表现出显著性差异（P<0.05）；11mg/L组活性最低，显示出一定的抑制作用，酶活性仅为对照组的52.7%，并且11mg/L组和2.2mg/L组间具有显著性差异（P<0.05）。但各处理组活性与对照组之间不具有显著性差别（P>0.05）。

    2.2.2吡虫啉对克氏原螯虾鳃Na+-K+-ATPase活性的影响

    亚致死浓度吡虫啉胁迫对受试克氏原螯虾 Na+-K+-ATPase活性的影响见上图。实验结果表明，随着胁迫浓度的增加，其活性总体呈现先下降后上升的趋势，这与氯氰菊酯胁迫后，其Na+-K+-ATPase活性变化有着较大的差别，并且处理组间活性差异显著（P<0.05），2.2和6.6mg/L两处理组活性与空白对照组活性存在显著性差异（P<0.05），8.8mg/L处理组与其它各组间也均表现出显著性差异（P<0.05）。

    2.2.3讨论

    从之前的一些学者的研究结果知道，绝大多数的有机农药会抑制水生生物乙酰胆碱酯酶的活性，但在本实验中，低浓度的吡虫啉对受试虾乙酰胆碱酯酶没有表现出明显的抑制作用，仅当浓度增加到11mg/L时，其活性才开始被有所抑制，这与氯氰菊酯对克氏原螯虾乙酰胆碱酯酶的影响结果一致。但对Na+-K+-ATPase酶活性的影响则没有表现出很明显的规律性，大致为低浓度时抑制，浓度增加时反而被诱导，活性较对照组高，这与氯氰菊酯对该虾Na+-K+-ATPase的影响结果有很大的不同，前者是活性随胁迫浓度的升高，其活性逐渐下降，而后者则为先下降后上升。因此本文认为受试克氏原螯虾乙酰胆碱酯酶和Na+-K+-ATPase酶对吡虫啉这种农药的敏感性不高，这可能与不同生物对不同农药的解毒酶所起的作用不同有关。至于如何对乙酰胆碱酯酶和Na+-K+-ATPase酶产生抑制和诱导效应，是直接抑制或诱导酶活性还是中毒后引起异常生理变化，还是间接引起酶活性降低，尚有待进一步研究。

    3 小结

    在系列亚致死浓度的氯氰菊酯和吡虫啉农药胁迫下，克氏原螯虾鳃的乙酰胆碱酯酶和Na+-K+-ATPase酶表现出不同的敏感性。乙酰胆碱酯酶（AChE）在两种农药胁迫下均表现为一定的诱导作用，Na+-K+-ATPase酶在氯氰菊酯胁迫下表现为较明显的抑制作用，但在吡虫啉胁迫下，活性变化规律不是很明显，总体为先下降后上升。实验结果表明，氯氰菊酯和吡虫啉对克氏原螯虾神经毒害的作用不明显，氯氰菊酯对其膜功能有较大的影响，吡虫啉对膜功能则不具有较强的毒性作用。

    参考文献：

    [1]黄婷.氯氰菊酯和吡虫啉对克氏原螯虾耗氧率和排氨率的影响[J].科技经济市场，2011（5）.