魁蚶AFLP反应体系的建立

    姚红伟+高悦勉

    摘要：以魁蚶为研究材料，建立了魁蚶的AFLP分子标记反应体系。对其分析过程中的酶切链接、预扩增、选择性扩增等试验条件进行了检测与筛选，得到了清晰的AFLP指纹图谱，为探讨魁蚶种群之间的遗传关系和遗传图谱的构建等方面提供了新的技术手段。

    关键词：魁蚶；AFLP；反应体系

    魁蚶（Scapharca broughtonii）也叫血贝或赤贝，属软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibranchia），翼形亚纲（Pterimorphia），蚶科（Arcidae），是一种大型蚶类。在我国分布海域为黄海、渤海及东海，以黄海北部和渤海较多。AFLP（扩增长度片段多态性）是一种检测DNA多态性的分子标记方法，具有多态性高，DNA用量少，检测效率高，可靠性好，分辨率高和无需预先知道基因组信息等优点。目前AFLP技术在泥蚶[1]、青蛤[2]、大竹蛏[3]、菲律宾蛤仔[4]以及扇贝[5]等贝类中有所应用，但是还未见用于魁蚶研究的报道。本文以魁蚶为实验材料，选用常规PCR试剂和合成引物等化学药品，探索出适合于魁蚶的AFLP分子标记反应体系。

    1材料与方法

    1.1材料

    本实验采用魁蚶的斧足肌肉，活体解剖，-84 ℃保存。所用魁蚶样本采自大连庄河海域的自然群体种贝。EcoRI和MseI引物及人工接头均由上海生工合成，所用主要药品中的剥离硅烷为北京鼎国生物技术有限责任公司产品，亲和硅烷、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为BBI公司产品，蛋白酶K、RNaseA酶为AMRESCO公司产品，MseI内切酶为NEB公司产品，Tap酶为上海生工销售的Roche公司分装产品，T4DNA连接酶和EcoRI内切酶都是Fermentas公司产品。实验所用仪器为PCR扩增仪（MG48+）、电泳仪（DYY-10C）、电泳槽（DYCZ-20B）等。

    1.2方法

    1.2.1魁蚶基因组DNA的提取魁蚶基因组DNA的提取采用苯酚-氯仿法。在1.5 mL离心管中加入600 μL的裂解液，取大约0.1 g魁蚶斧足肌肉置于其中剪成匀浆状后加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），将其混匀后置于55 ℃电热恒温箱中消化1.5 h，消化期间每隔15 min轻轻摇匀一次。将已消化完的澄清液冷却至室温加入600 μL苯酚，上下颠倒离心管混匀15 min，然后8 000 r/min离心10 min。取500 μL上清液置于另一离心管中，加入600 μL的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）上下颠倒离心管混匀15 min后，8 000 r/min离心10 min。取400 μL上清液置于另一离心管中，再加入600 μL的氯仿∶异戊醇（24∶1）上下颠倒离心管混匀15 min后，8 000 r/min离心10 min。取300 μL上清液置于另一离心管中，加入4 μL RNase A酶（10 mg/mL），37 ℃恒温消化30 min后加入两倍体积的预冷无水乙醇轻轻颠倒，待絮状白色沉淀混匀后，室温下静置15 min左右。之后将装有白色絮状沉淀的离心管12 000 r/min离心20 min，用预冷的70%的乙醇进行洗涤，共洗涤两次。然后弃去乙醇，室温干燥后加入50 μL的灭菌去离子水，待溶解后置于-20 ℃贮存。取3 μLDNA样品与3 μL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量。在此基础上将其稀释至50 ng/ μL的浓度，作为双酶切和连接的模板DNA浓度。

    1.2.2酶切与连接本实验将酶切和连接同时进行。在200 μL PCR管中分别加入：5 μL DNA模板（50 ng/μL），0.2 μL的100×BSA（10 mg/mL），1 μL的MseI接头（50 μmol/L）和1 μL的EcoRI接头（5 μmol/L），1.5 μL的10×T4DNA buffer和0.8 μL 的T4DNA连接酶（5 U/μL），0.3 μL 的EcoRI内切酶（10 U/μL），0.6 μL 的MseI内切酶（10 U/μL），加ddH2O补足25 μL的反应体系。在PCR仪中37 ℃温育8 h后取出，置于-20 ℃保存。

    1.2.3预扩增预扩增反应包括：4 μL酶切连接液，2 μL的10×PCR buffer，1.8 μL的dNTP（2.5 mmol/L），预扩增引物（10 μmol/L）各0.6 μL，1.2 μL的Mg2+（25 mmol/L），0.12 μL 的Tap酶（5 U/μL），加ddH2O补足20 μL的反应体系。混匀后按如下PCR反应程序扩增：第一步94 ℃预变性2 min；第二步94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，此步骤共30个循环；最后72 ℃ 5 min。预扩增反应结束后，将其从PCR仪中取出，置于-20 ℃保存。

    1.2.4选择性扩增预扩增结束后，将其产物分别稀释10倍、20倍、30倍、50倍、80倍和100倍的6个梯度进行选择性扩增，其反应包括：4 μL预扩增稀释液，选择性扩增引物（10 μmol/L）各1.4 μL，3.6 μL的dNTP（2.5 mmol/L），2 μL的10×PCR buffer，1.4 μL的Mg2+（25 mmol/L），0.18 μL的 Tap酶（5μU/ μL），加ddH2O补足20 μL的反应体系。混匀后按如下PCR反应程序扩增：第一步94 ℃预变性2 min；第二步94 ℃ 40 s，65～56 ℃ 40 s（每循环退火温度降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，此步骤共13个循环；之后变为94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，此步骤共30个循环；最后72 ℃ 5 min。选择性扩增反应结束后，将其从PCR仪中取出，置于-20 ℃保存。

    1.2.5凝胶制备及银染选择性扩增PCR反应结束后进行凝胶制备，将6%的丙烯酰胺溶液50 mL与200 L的10%的过硫酸铵（APS）以及25 L的TEMED混合摇匀，待胶灌满玻璃板后插入梳子，静置凝集1.5 h左右，然后50 W恒功率预电泳胶板30 min。在此期间在选择性扩增产物中加10 L甲酰胺上样缓冲液，94 ℃变性5 min后立即放于冰上，预电泳结束后取7 L变性样品迅速加入点样孔，50 W恒功率电泳2 h左右。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，将粘有胶的玻璃板置于1.5 L的10%冰乙酸溶液中轻轻摇晃30 min，用去离子水漂洗2次，每次5 min。然后在1.5 L新配置的染色液中（0.1%AgNO3，2.25 mL 37%甲醛）摇晃30 min，取出后立即用去离子水漂洗，时间不超过10 s。将冲洗后的玻璃板迅速放入1.5 L显影液中（45 g无水NaCO3，300 L的10 mg/mL Na2S2O3，2.25 mL 37%甲醛）轻轻摇晃，直至出现带纹。最后在10%冰乙酸溶液中定影5 min，再用去离子水漂洗，室温下自然晾干。

    2结果与检测

    2.1模板DNA的检测

    对提取的魁蚶基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示主带清晰完整，没有拖尾现象。利用OPTIZEN 2120UV型紫外分光光度仪测定DNA质量很高，符合实验要求。魁蚶基因组DNA片段大小在23 kb以上，如图1所示，图中所用Marker为λDNA/HindⅢ。

    图1 魁蚶基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果

    2.2双酶切及连接检测

    本实验双酶切采用较为常用的两种酶EcoRI和MseI，双酶切及连接反应后的液体采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果如图2所示，酶切连接后的基因组DNA呈均匀的弥散状（smear），片段大小主要集中在100～1 500 bp之间。

    2.3预扩增检测

    本试验用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增结果，如图3所示，预扩增片段呈弥散状（smear），各样品扩增强度基本一致。

    2.4选择性扩增检测

    30个个体选择性扩增结果

    本实验将预扩增产物进行梯度稀释，发现其选择性扩增结果差别不大。因此，在实验过程中选择稀释20倍即可。本实验从64对引物组合中采用筛选出的引物组合（E-ACA，M-CAT） 即E35M59进行选择性扩增，检测结果如图4所示，指纹图谱条带清晰可见，信号强，多态性丰富，无背景干扰，说明AFLP指纹图谱质量很高。3讨论

    本实验旨在建立AFLP用于魁蚶分子标记研究的反应体系，由于AFLP标记技术可采用不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基，因此理论上AFLP标记技术能产生无限多的标记数而且可以覆盖整个基因组，其多态性远远超过其他分子标记。然而该技术涉及诸多步骤，因此要保证各环节符合要求才能得到理想的结果：（一）高纯度基因组DNA的制备是AFLP成功的关键，若DNA中蛋白质含量多，则首先影响酶切效果或根本无法酶切。此外还要注意样品是否新鲜以避免提取的DNA有降解或损伤。（二）酶切和连接可同时进行，也可单独进行，本实验为优化实验步骤，减少繁琐操作，采用同时酶切和连接，在实际操作时要将PCR盖口盖紧，以免样品蒸发。酶切和连接必须彻底，所以反应时间要有保障，但是时间过长又没有必要，根据实验所加试剂的量，笔者摸索出8 h左右即可。（三）在PCR扩增反应过程中各试剂成分间存在着动态的平衡和制约。对于预扩增和选择性扩增PCR反应来说，Mg2+浓度至关重要。这是因为Mg2+不仅可以与Taq酶结合，激活其活性，而且可以和反应体系中的dNTP和引物等结合，降低其实际浓度。所以当Mg2+浓度过低时，Taq酶活力跟着降低，从而使PCR扩增出的条带数目少而模糊，而当Mg2+浓度过高时，又会对Taq酶产生抑制作用，从而使PCR扩增出的条带产生拖尾并催生非特异性扩增。此外，为使PCR效率达到最高，必须保证反应混合物中有足够量的dNTP，但是dNTP用量过高会增加碱基的错误掺入率。本实验中dNTP和Mg2+浓度对PCR扩增产物的质和量影响较大，因此笔者设置其浓度正交试验最终得以确定Mg2+预扩增的用量是1.2 μL（25 mmol/L），选择性扩增的量是1.4 μL（25 mmol/L）。dNTP预扩增用量1.8 μL（2.5 mmol/L），选择性扩增用量3.6 μL（2.5 mmol/L）。模板DNA的质量也是影响PCR扩增的重要因素，但是由于AFLP对模板DNA反应浓度并不敏感，因此不再对模板浓度进行梯度调整，直接采用了250 ng。另外，很多实验例如像SSR分子标记中会采用TE溶液稀释DNA，但是TE中的EDTA会影响PCR反应中Mg2+的实际浓度，所以为了消除此影响，本实验采用ddH2O来代替TE。对于引物量的调节也不是越大越好，通过实验发现，随着引物量的增加，能看到更多扩增的条带，但是引物浓度过大，则会产生拖带，并且主带减少。Taq酶在碱性环境活性较高，过酸过碱都会影响PCR扩增，在试验过程中发现随着Taq酶量的增加，扩增条带会变粗，本实验选择性扩增中，Taq酶的用量确定为0.18 μL（5 U/μL），过多会增加试验成本和非特异性扩增产物，过少则会减少扩增产物的量。另外，不同厂家生产的Taq酶的浓度和扩增效果并不一致，因此要使用固定厂家的Taq酶。最后需要注意的是AFLP选择性扩增循环次数一般28～30次即可用于变性聚丙烯凝胶电泳检测。（四）在凝胶制备过程中有时能看到胶体中出现小的气泡，这样会使最后跑出的谱带形状弯曲变形或无法识别，因此在制备过程中要注意玻璃板上没有任何杂质，在灌胶的时候保持胶体连续流入两块玻璃板之间，在胶体预电泳后要用吸管仔细吹吸加样槽以防加样时再次混入气泡。实验中预电泳的时间太短也会导致正式电泳后条带发虚模糊不清，时间过久胶体温度过高则会出现拖带。最后在染色液中一定要摇晃够半小时，否则条带会模糊。而在显影液中时，漂洗时间不宜超过10 s，否则会导致条带模糊甚至消失。

    4展望

    近年来海洋贝类养殖发展迅速，对海洋贝类遗传变异研究也广泛开展，而蚶类研究较少。目前，我国不同地理群体魁蚶的遗传背景尚不完全清楚，这都有待于今后进一步的研究。因此本试验建立AFLP反应体系可以为将来魁蚶遗传多样性的进一步研究奠定基础，了解其遗传背景，并且为充分了解我国魁蚶自然群体的种质状况、资源的恢复和保护及遗传改良以及选择优良的种贝和辅助育种方面提供技术支持。

    参考文献：

    [1] 董迎辉，姚韩韩，林志华，等.泥蚶生长性状相关AFLP分子标记的筛选[J].水产学报，2012，36（6）：825-831

    [2] 娄秦爱，孙长森，钱志阳，等.青蛤不同地理群体遗传结构差异的AFLP分析[J].水产学报，2012，40（9）：5249-5251

    [3] 张滔，刘相全，孙振兴，等.大竹蛏（Solen grandis）不同地理群体遗传多样性的AFLP分析[J].海洋与湖沼，2013，44（2）：525-530

    [4] 邹琰，李莉，张良，等.山东沿海菲律宾蛤仔不同地理群体遗传多样性的AFLP分析[J].海洋科学，2014，38（2）：76-79

    [5] 周丽青，杨爱国，刘志鸿，等.基于遗传连锁图谱筛选虾夷扇贝性别相关AFLP分子标记的方法[J].渔业科学进展，2014，35（6）：103-109