RT—PCR技术在诊断H5亚型禽流感病毒中的应用

    周建红等

    

    摘要:按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T 772-2004)设计合成了针对H5的引物,建立了一种对禽流感(AIV)一步法RT-PCR的快速诊断方法。结果表明,该方法具有高效,快速,特异性强,敏感性高等特点,可基本满足当前的检测需要。

    关键词:禽流感;RT-PCR;检测

    中图分类号:S858.3 文献标识码:A 文章编号:1007-273X(2015)07-0011-02

    禽流感是由A 型流感病毒(AIV)引起的一种禽类的疾病综合征。因其传播快、危害大,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病,我国将其列为一类动物疫病[1]。该病对养殖业生产危害性极大,是世界各国防疫的重点对象。控制禽流感关键在于早发现、早隔离、早预防。因而快速、敏感、特异的诊断方法受到人们的关注。目前对AIV进行快速检测的方法有IFA、ELISA、RT-PCR、Real-time RT-PCR、NASBA和Microarray等。随着PCR技术的不断完善和发展,该技术已逐渐应用于各类疫病的诊断。对于禽流感检测,它可通过基因序列和结构分析,从分子和基因水平直接对临床病料或鸡胚培养物进行禽流感病毒(AIV)型、亚型及不同毒力株的检测[2]。本文就RT-PCR技术检测H5亚型禽流感病毒的试验报告如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    (1)禽流感病毒阳性对照(已灭活)。

    (2)主要试剂:RNA提取试剂盒为美国OMEGA公司产品。RT-PCR试剂盒为宝生物工程大连有限公司产品。低分子量蛋白质Marker、琼脂糖为OXOID产品。

    (3)引物:根据中华人民共和国农业行业标准(NY/T 772-2004)合成了1对引物,上游引物(P1):5′-ACACATGCYCARGACATACT-3′;下游引物(P2):5′-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3′;引物之间跨度为545 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 病毒总RNA的提取

    采集的口腔、泄殖腔棉拭子分离后收集上清,RNA 病毒的抽提按试剂盒说明书进行。

    1.3 RT-PCR反应

    RT-PCR采用一步法,参照TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)(TaKaRa)操作说明,利用上述引物P1、P2分别对提取的RNA进行RT-PCR 扩增。RT-PCR 反应体系如下:10×One step RNA PCR Buffer(TaKaRa)5 μL,dNTP(10 mmol/L)5 μL,MgCl2(25 mmol/L)10 μL,RNase Inhibitor (40 U/μL)1 μL,AMV RTase XL(5 U/μL) 1 μL,AMV-Optimized Taq(5 U/μL)1 μL,上下游引物(20 μmol/L)各1 μL,RNA 模板3 μL,补充ddH2O至50 μL。反应程序:50 ℃反转录30 min;94 ℃预变性2 min;94 ℃变性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃ 延伸1 min,35个循环,72 ℃延伸10 min。

    1.4 特异性试验

    取CSFV、PRRSV、NDV按照OMEGA说明书提取总RNA,按照1.3进行RT-PCR。

    1.5 RT-PCR产物电泳检测

    RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳,当溴酚蓝电泳至适当位置,在长波紫外灯下/凝胶成像系统观察或拍照。

    2 结果与分析

    2.1 禽流感RT-PCR扩增结果

    提取总RNA,RT-PCR扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,阳性对照获得大小为545 bp 左右的片段,与设计长度一致(图1)。

    2.2 特异性试验结果

    特异性试验结果表明,仅禽流感阳性株在545 bp处出现了一条带,而CSFV、PRRSV、NDV均为阴性。

    2.3 临床样品的检测结果

    从某鸡场采集40份样品进行RT-PCR检测,未见有阳性。

    3 小结与讨论

    H5亚型禽流感由于在家禽中流行较为广泛、危害大,特别是高致病性禽流感可引起鸡群100%死亡,给养殖业造成了巨大损失。

    为进一步减少损失,及时对禽流感的发生做出早期诊断,并进行预警预报,我们按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T 772-2004)设计合成了针对H5的引物,建立了一种对AIV一步法RT-PCR的快速诊断方法,该方法具有高效,快速,特异性强,敏感性高等特点,可基本满足当前的检测需要,为禽流感的预防和确诊提供了保障。

    参考文献:

    [1] 卡尔尼克B W.禽病学[M].第九版.北京农业大学出版社.199l.

    [2] 彭晓玲,兰 玲,马亚珍,等. 高致病性禽流感RT-PCR快速诊断方法的建立[J].动物医学进展,2009,30(1): 40-42.

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