影响口蹄疫贴壁种毒质量因素的探讨与分析

    李培林等

    

    

    

    摘 要：口蹄疫灭活疫苗目前仍然是控制口蹄疫的主要手段，随着悬浮工艺和纯化工艺的改进，使口蹄疫灭活疫苗的质量有很大的提高。探讨了细胞状态、接毒量和毒液保存条件对种毒质量的影响。结果表明，细胞状态影响收毒时间的变化，同时一定程度上也影响LD50的变化；接毒含量增高，收获时间缩短，而低剂量、正常剂量接毒传代试验均能获得合格的种毒支系，适宜的改变接毒量有助于提高种毒质量；不论是4 ℃冷藏保存还是-20 ℃冷冻保存，随着保存时间的延长，毒价均有不同程度的损失，而且4 ℃保存的毒液下降率明显低于-20 ℃保存方式。

    关键词：BHK-21细胞；口蹄疫灭活疫苗；种毒制备；质量控制

    中图分类号：S852.659.6 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2015）07-0007-03

    口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，严重危害畜牧业的发展[1，2]。OIE将该病列为A类家畜传染病之首，而我国农业部也把该病列为第一类防控疫病。对于口蹄疫的防控，目前仍以灭活疫苗为主。此项措施在我国重大疫情中发挥巨大防治作用。

    对于口蹄疫疫苗生产企业，质量的提高，产品创新以及员工素质提高是企业发展的动力。因此，疫苗质量的提高离不开工艺革新以及基础方面的优化研究。工艺革新是疫苗制备企业的硬件系统，由企业的综合实力决定。而基础研究主要包括：种细胞的驯化与筛选、种毒的优化制备及抗原纯化等相关研究[3，4]。从种毒制备人员的自身素质讲，筛选制备出良好的种毒，不仅给疫苗前端解决了问题，而且也给后端工艺带来可喜的成果。因为种毒质量好坏、抗原含量高低，直接影响口蹄疫抗原中的有效成分，而且关系到疫苗的免疫效果。在生产中获得一支理想的种毒支系，不仅给生产人员带来方便，而且也给企业带来很大的经济收益。因此，制苗毒株的选择及质量的提高是疫苗生产的首要问题[6]。

    筛选优质的种毒需要有正确的操作方法更需要掌握影响种毒质量的一些因素。目前，影响贴壁种毒因素主要有细胞贴壁状态、维持液的酸碱度、接毒量、最佳收获时间、检验周期、种毒保存时间以及种毒传代路线及无菌观念等。因此，本次试验主要探讨影响种毒质量的一些因素，并进行分析与总结，从而通过过程控制，调整传代条件、保存方法，筛选出毒价稳定、146S高的基础种毒，从而保障种毒质量，提高企业竞争力。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 仪器与设备 CO2培养箱（Thermo 8000WJ）；生物安全柜（HFsafe-1200型）；倒置显微镜清（OLMPUS）；4 ℃平温冰箱；-20 ℃卧式冷冻冰柜；温室、生物细胞转瓶机、细胞观察台；超低温冰箱（Thermo ULT1386-3-V41）、移液器、恒温震荡培养箱等仪器。

    1.1.2 BHK-21细胞 由金宇保灵生物药品有限公司提供，分种传代一般按1∶3～1∶4进行操作，加入营养液，置37 ℃培养箱中培养。营养液配制按本公司的配液SOP进行操作。

    1.1.3 O型口蹄疫基础种毒 由金宇保灵生物药品有限公司质量检验部提供FMDV基础种毒。

    1.2 方法

    1.2.1 BHK-21细胞贴壁状态对种毒的影响 按常规细胞传代的方法，将细胞复苏传代后，将同批培养24、48、53、72、96 h细胞，每瓶细胞换液，加入病毒维持液100 mL，同时每个培养时间设两个重复，分别按5%～8%的接毒量接毒，接毒完成后置CO2培养箱37 ℃培养6～8 h观察，病变达到90%时收获病毒冷冻保存后混匀测病毒含量（取平均值）。

    1.2.2 改变接种比例对筛选种毒的影响 选同批48 、72 h培养阶段的BHK-21细胞，细胞换液，加病毒维持液100 mL，一组以7%～8%的接毒量接毒，另一组以1%接毒量接毒，置CO2培养箱37 ℃培养6～8 h观察，病变达到90%时收获病毒冷冻保存后混匀测病毒含量，连续传代3次。

    1.2.3 不同保存方式对种毒质量的影响 通过测毒结果筛选出毒价高和毒价低的种毒，然后分别将上述两种种毒，进行4 ℃和-20 ℃冷冻保存，保存期限为210 d，经过测毒结果分析计算不同时间毒价的损失率，毒价损失率=原样毒价-不同时间段的毒价/原样毒价，记录结果。

    1.2.4 LD50测定 用pH为7.6～7.8的细胞维持液将待测各批次种毒样品进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，每个稀释度颈背部皮下接种2～3日龄乳鼠4只，设对照2只，每只注射0.2 mL，接种后观察7 d，根据发病死亡乳鼠数按Reed-Muench法计算LD50。

    2 结果与分析

    2.1 BHK-21细胞贴壁状态对种毒因素的影响

    由表1、图1可知，随着BHK-21细胞培养时间的延长，即细胞从24 h到96 h 的过程中，细胞表现基本形成单层、致密单层、脱落等现象的发生。因此，选择不同培养时间段的细胞，对筛选种毒支系有一定的影响，从上述数据分析可知，细胞培养时间与收毒时间存在一定的相关性，从LD50毒价（LD50的值为10N LD50/0.2 mL中N的值，下同）分析可知，毒价上升的阶段对应的是细胞48～72 h培养阶段。

    2.2 改变接种比例对筛选种毒的影响

    从表2可知，按7%～8%种毒含量，连续传3代，种毒LD50基本在7.5～8.0范围内变化，说明按7%～8%正常含量接毒，可以得到理想的种毒支系。而且可以保证抗原的正常生产。从收毒时间分析，随着代次的增加收毒时间逐渐在缩短，而细胞颗粒饱满时间基本稳定在8.5～11.5 h范围内。

    从表3低剂量组数据分析可知，以1%种毒含量进行接毒传代，种毒LD50在7.0～8.0范围内变化，而且通过收毒时的观察，SY001F10代毒价不合格，通过后续连续传代，收毒时间缩短毒价升高，可以初步证明，用低剂量接毒方法可以盲传两到三代，毒价基本趋于合格。说明这种传代方法，可以达到生产的要求，而且这种工艺有一定的可行性。经表2与表3对比分析可知，正常剂量组与低剂量组种毒传代方式最大的不同，种毒含量高收毒时间快，种毒含量低收毒时间慢，即种毒含量的多少与收毒时间呈一代的正相关性，测毒结果与细胞病变情况，两种方式基本一致。

    2.3 贴壁种毒不同保存方式对种毒质量的影响

    从表4、图2可知，不论是4 ℃保存和还是

    -20 ℃冷冻保存，随着保存时间的延长，毒价均有不同程度的损失，从保存条件分析，4 ℃保存的毒液下降率明显低于-20 ℃保存方式。从毒价高低分析可知，在大部分保存时间内，在4 ℃保存高毒价的下降率明显低于4 ℃保存低毒价的下降率，而-20 ℃保存方式也有上述规律，这就说明，保存方式和毒价高低影响贴壁种毒的质量。

    3 讨论

    3.1 BHK-21细胞贴壁状态及传代稳定性对筛选种毒质量的影响

    细胞培养时间、分种比例、细胞营养液以及不同种类的血清与添加量，均能影响贴壁细胞状态与形态。而本次试验在固定分种比例、营养液以及血清因素同时，只考虑细胞培养时间对筛选种毒支系的影响，旨在探讨细胞培养时间与种毒质量的关联性。在实际工作中，细胞状态是指细胞的致密程度、融合率及细胞肉眼观察情况。细胞状态影响收毒时间的变化，同时也一定程度上影响LD50毒价的变化。一般情况，不同培养阶段BHK-21细胞，细胞的致密度与薄厚度不一致，在接毒量一致的情况下，细胞培养时间会影响CPE收获时间，从而间接的影响毒价。在实际工作中，尽量选择细胞形态好，培养时间在48～72 h细胞进行接毒，同时在工作中加无菌观念意识，在一定程度上，利于筛选优质的种毒。

    3.2 不同的接种比例对筛选种毒的影响

    在细胞状态良好，细胞培养时间一定的情况下，贴壁种毒接毒含量增高，收获变时间缩短，反之亦然。经报道，接毒量高低直接影响病毒繁殖周期，细胞病变快慢直接影响细胞维持液的酸碱度及营养物质的消耗快慢，这些因素的变化会直接影响完整病毒粒子的情况。通过本次试验结果可知，低剂量、正常剂量接毒传代试验均能获得合格的种毒支系。因此，在实践中，适宜的改变接毒量有助于提高种毒毒价。所以，在种毒传代中多注意上述问题。

    3.3 贴壁病毒液的不同保存条件对种毒质量的因素的影响

    在口蹄疫灭活疫苗制备过程中，不可避免的要将基础种毒、抗原灭活液、成品苗进行保存，选择适宜的保存条件和储备方法，对疫苗质量的提高有一定的指导意义。大量资料报道表明[5]，冷链系统是口蹄疫苗的主要储存和运输方式，可见如何有效的保存疫苗终端产品也是疫苗质量提高的关键。本次试验证明，不论是4 ℃平稳保存和还是-20 ℃冷冻保存，随着保存时间的延长，毒价匀有不同程度的损失，而且4 ℃保存的毒液下降率明显低于-20 ℃保存方式，本次结果与一些报道有所差距。经查阅资料分析有如下原因所致，因为在保存口蹄疫抗原或毒液时，大部分采用的是缓冲体系来保存，在4 ℃或-20 ℃保存条件下，-20 ℃保存条件下更容易使缓冲体系酸碱度发生变化，从而使毒液中的完整病毒粒子更容易降解，影响口蹄疫病毒质量。

    疫苗制备过程是一个系统过程，此次试验只是从种毒方面进行了初步探讨，细胞培养时间的变化、接毒量的变化以及毒液保存条件的改变对贴壁种毒质量的影响。因此，在实际工作中细化深入的研究，对口蹄疫疫苗质量的提高会有一定的指导意义。

    参考文献：

    [1] COX S J， BARNETT P V. Emergency vaccination of sheep against foot and mouth disease：protection against disease and reduction in contact transmission[J]. Vaccine， 1999， 17： 1855-1868.

    [2] MURRAY P.K. A review of foot and mouth disease international vaccine banks. In Proc. National symposium on foot and mouth disease[J]. Australian Government Publication Service， 1992，10：115-123.

    [3] DETROY R W，STILL P E.Penicillium stoloniferum virus： large-scale concentration and purification by polyethylene Glycol[J]. American Society for Microbiology，1974 ，10：733-735

    [4] PANINA G F， SIMONE F D.Immunological activity of foot-and-mouth disease virus purified by polyethylene glycol precipitation[J]. Verlag Paul Parey， Berlin und Hamburg，1973， 20：773-782 .

    [5] ALLENDE R M. South American standards for Foot-and-mouth disease vaccine quality[J]. Foot-and-mouth Disease： Control Strategies， 2003，10：331-336.

    [6] 王永录，张永光.口蹄疫A型灭活疫苗毒种和种子批的研究[J]中国兽医科学，2006，36（5）：371-375.