离子液体—基质固相分散—超声雾化—固相萃取结合高效液相色谱法检测人参中三嗪类除草剂
陈一鑫+冯清胜+王晓中+李兰杰+李绪文+金永日
摘 要 采用固载1甲基3己基咪唑六氟磷酸（[C6MIM][PF6]）的硅胶作为基质固相分散剂， 与超声雾化提取及C18固相萃取相结合，对人参提取物进行提取和净化； 采用高效液相色谱法，建立了人参中5种三嗪类除草剂的检测方法。样品前处理的最优条件为：300 mg人参粉末与150 mg硅胶（[C6MIM][PF6]含量2.0 mmol/g）研磨5 min，以20.0 mL去离子水（pH 7，含1.0% NaCl）超声雾化提取10 min，再以 5.0 mL 乙腈洗脱萃取小柱（300 mg C18）。实验结果表明，目标物的检出限为0.020～0.035 g/g，线性相关系数r2≥0.9992， 实际样品加标回收率为78.2%～95.4%，相对标准偏差为3.5%～6.0%。本方法快速高效、净化效果好、提取率高，为中药中农药残留的检测提供了新的样品前处理方法。
关键词 人参； 三嗪除草剂； 离子液体； 基质固相分散； 超声雾化； 固相萃取
20160124收稿；20160406接受
Email： jinyr@jlu.edu.cn
1 引 言
超声雾化提取（UANE）是基于超声辅助提取的一种新型提取方法，除具有超声辅助提取法所具有的空化效应、机械效应和热效应外，还具有喷泉效应，可利用产生的气溶胶和喷泉加速目标分析物的传质，便于与其它技术联用[1]，富集与净化可同时完成。目前，超声雾化提取技术主要应用于植物成分提取[2～8] 和农药残留物分析[9]等； 但存在雾化功率较小以及气溶胶分布不均匀等问题，稳定性略差且气溶胶的利用率较低，因此难以在农药残留分析中广泛应用。
三嗪类除草剂应用较广，在土壤和水体中残留时间较长，因此会污染人参种植地， 使人参带有三嗪除草剂。目前，针对三嗪类除草剂的检测方法比较成熟[10～13]，相关的样品前处理方法已有大量报道[14～16]。但是因为人参中成分复杂，采用高效液相分析三嗪除草剂时，检测波长与人参成分的吸收波长比较相近， 所以需要高效的前处理方法，以减少人参成分的干扰。
离子液体固载基质固相分散（ILMSPD）[17]是基于基质固相分散（MSPD）[18，19]发展起来的一种新的样品处理技术，具有提取率高、有机溶剂用量少的特点，但是存在操作过程繁琐、洗脱溶剂难于浓缩与定容等问题。为提高UANE的稳定性和样品净化效果，简化ILMSPD操作过程，缩短提取时间，同时实现目标物的提取、富集与净化，本实验采用固载离子液体的基质固相分散与超声雾化提取以及固相萃取相结合的方法提取人参中常用5种三嗪类除草剂，并利用高效液相色谱法测定其含量，建立了人参中三嗪类除草剂残留量的快速、准确、灵敏的分析方法。本方法可作为一种新的农药残留样品前处理方法，用于中药中农药残留的检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Aglient 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配Aglient 1200工作站、紫外检测器（VWD）。超声雾化提取装置（图1）由超声雾化加湿器（北京亚都科技有限公司）改造而成； 超声功率最大为35 W，频率为1.7 MHz； 超声雾化提取瓶内径6 cm，底端开口用PVC薄膜密封，顶端开口用于填加样品、提取液及安装固相萃取装置。
莠灭净（Ametryn）、阿特拉津（Atrazine）、敌草净（Desmetryn）、扑灭津（Propazine）和西玛津（Simazine）5种三嗪类除草剂标准品（纯度>99%，Dr. Ehrenshtofer公司）； 色谱级甲醇和乙腈（Sigmaalrich公司）； C18（200～300目，绿百草科技发展有限公司）； 硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）； 中性氧化铝（200～300目）和硅藻土（200～300目， 上海国药集团）； 固相萃取小柱及筛板（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。 3种离子液体： 1丁基3甲基咪唑六氟磷酸盐{[C4MIM][PF6]}、1甲基3己基咪唑六氟磷酸盐{[C6MIM][PF6]}、1甲基3辛基咪唑六氟磷酸盐{[C8MIM][PF6]}（纯度均大于98.0%，上海成捷化学有限公司）。其它试剂均购自北京化学试剂厂。
2.2 仪器条件
HPLC色谱分离条件： Aglient Zorbax SBC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30℃；流动相为乙腈（A）水（B）；流速0.8 mL/min；梯度洗脱：0～8 min，35%～50% A；8～15 min，50% A；15～20 min，50%～55% A；检测波长228 nm；进样量20 μL。
2.3 实验方法
将300 mg 人参粉末、200 μL去离子水和150 mg表面固载有[C6MIM][PF6]的硅胶一同研磨5 min，混合物转移至超声雾化提取瓶中，加入20.0 mL去离子水作为提取剂。将填装有300 mg已活化的C18固定相的固相萃取小柱安装到提取瓶上，连接真空泵。开启真空泵，打开提取器开关，调节功率至35 W，提取10 min； 取下固相萃取小柱，加入10 mL去离子水冲洗，以真空泵抽干，用6.0 mL乙腈洗脱，收集洗脱液，40℃减压蒸干； 加入200 μL甲醇复溶，过0.22 μm滤膜，进样高效液相色谱仪分析。
2.4 超声雾化固相萃取（UANESPE）
将300 mg加标样品粉末和20.0 mL去离子水加入超声雾化提取瓶中，后续操作过程同2.3节，仅提取时间调整为15 min。
2.5 硅胶基质固相分散超声雾化固相提取（SGMSPDUANESPE）
将300 mg 加标样品粉末、200 μL去离子水和150 mg硅胶研磨5 min，混合物转移至超声雾化提取瓶中，后续操作过程同2.3节。
2.6 基质固相分散（MSPD）
将300 mg 加标样品粉末、200 μL去离子水和150 mg表面固载有[C6MIM][PF6]的硅胶加入玛瑙研钵，研磨5 min。将粉末加入装有300 mg C18的固相萃取柱中，用20.0 mL去离子水淋洗，吹干，后续操作过程同2.3节。
3 结果与讨论
3.1 固化载体选择
按文献[20，21]的方法考察了4种固化载体：硅胶、中性氧化铝、硅藻土和C18。结果表明，硅胶对离子液体的固载效果最好，这与硅胶的比表面积较大及SiOH吸附作用力强有关，所以选择硅胶作为固化载体。
3.2 离子液体种类和吸附量的选择
硅胶表面固载离子液体方法采用直接浸渍法[20，21]。离子液体的烷烃链对提取存在影响，烷烃链长虽然有助于MSPD过程中小极性物质的提取，但是在UANE过程中，会增加提取液对固相萃取小柱的洗脱能力，降低分析物的回收率。实验结果表明，质量和固载浓度（0.0015 mol/g）相同，而烷烃链长度不同的离子液体（[C4MIM][PF6]，[C6MIM][PF6]，[C8MIM][PF6]）固载的硅胶中，[C6MIM][PF6]固载的硅胶对5种除草剂的回收率较高，故选择[C6MIM][PF6]。
离子液体的吸附量越多，同等质量的分散剂，固体成分越少，MSPD的提取效果越差，而UANE雾化效果越好，固载量由1.0～2.5 mmol/g的实验结果见图2a， 当离子液体的固载量为2.0 mmol/g时，分析物的回收率最高，因此离子液体固载量选择2.0 mmol/g。
3.3 分散剂的质量
在MSPD过程中，分散剂主要是破坏样品组织结构。但在超声雾化过程中，分散剂则会吸收超声波，减弱超声雾化提取的喷泉效应，阻碍气溶胶的形成。实验中考察了0.05～0.25 g分散剂对5种三嗪除草剂回收率的影响（图2b）。结果表明，分散剂质量为0.15 g时，分析物的回收率最高。因此，样品量为300 mg时，分散剂的质量选择为0.15 g。
3.4 pH值和离子强度的影响
考察了提取液pH值和离子强度对5种分析物回收率的影响。实验中使用HCl和NaOH调节溶液pH值。结果表明，当提取液pH值在6～7之间时，分析物的回收率较高，所以选择提取液pH值为7。
离子强度会影响分析物的回收率[22]，为防止引入其它离子，实验选择NaCl调节提取液的离子强度。结果表明，当NaCl的浓度为1%时，5种分析物的回收率最大，故选择提取液中的NaCl的浓度为1.0%。
3.5 固相萃取洗脱剂和体积的影响
因乙腈对人参中内源性物质溶解度较差，而对目标物洗脱效果较好，故选择乙腈作为洗脱剂，当乙腈体积超过5.0 mL时，目标物回收率变化不大，说明5.0 mL乙腈可以将目标物完全洗脱，所以洗脱体积选择5.0 mL。
3.6 工作曲线、检出限和定量限
按最优实验条件下提取不同加标浓度（0.10～20.00 μg/g）的人参加标样品，并进行高效液相分析，将得到的各目标分析物的峰面积对含量作图，绘制工作曲线，得到5种三嗪类除草剂回归方程和线性范围。按信噪比（S/N）为3和10测定各目标物的检出限和定量限，实验结果见表1，定量限色谱图见图3。
3.7 加标回收率和实际样品分析
采用本方法对购买的其它5个批次人参样品中的三嗪类除草剂进行检测，均未检出三嗪类除草剂。为了考察实际样品的基质效应，在人参中添加3个浓度水平（0.50， 5.00和15.00 μg/g）的除草剂，实验结果见表2，加标回收率为78.2%～95.4%，RSD为3.5%～6.0%。结果表明，本实验方法可以用于检测人参中的三嗪类除草剂。
3.8 方法对比
3水平（0.50， 5.00和15.00 μg/g）的加标样品按照2.4～2.6节方法进行处理，结果见表3。结果表明，基质固相分散超声雾化提取的回收率均高于单一使用超声雾化提取法或基质固相分散法，尤其是使用离子液体固载的硅胶作为分散剂时，目标物的回收率高于硅胶作为分散剂时的回收率。
4 结 论
本研究使用离子液体基质固相分散超声雾化固相萃取法提取人参中的5种三嗪类除草剂， 经考察相关影响因素，确立了最优提取条件，对6批次人参样品中的三嗪除草剂进行了检测。结果表明，与对比方法相比，本方法具有回收率高、操作简单、提取时间短等优点。本研究结果表明， 离子液体基质固相分散超声雾化固相萃取法可作为一种有效的中药中农药残留的提取方法。
References
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徐能斌， 冯加永， 朱丽波， 钱飞中， 徐立红， 陈钟佺， 汪晟乐. 分析化学， 2016， 44（1）： 117-123
Abstract A new ultrasonicassisted nebulization extraction （UANE） method coupled with silicasupported ionic liquid based matrix solid phase dispersion（SSILbased MSPD） and solid phase extraction（SPE） was established for the extraction of five triazine herbicides from root of Panax ginseng C.A.Mey. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine these analytes. Experimental parameters， which affect the recoveries of the analytes， were studied and optimized. The sample powder （300 mg） was mixed with 150 mg of silica gel （[C6MIM][PF6] 2.0 mmol/g）. After MSPD for 5 min， the mixtures were extracted in water （pH 7， NaCl 1.0%） by UANE for 10 min， and then eluted by 5.0 mL of acetonitrile from the SPE column （C18， 300 mg）. Under the optimized conditions， the LODs of these five triazine herbicides are in the ranges of 0.020-0.035 μg/g， the concentration range of linear relationship of analytes （r2≥0.9992） are in the ranges of 0.15-20.00 μg/g. The recoveries of these five triazine herbicides are in the ranges of 78.2%-95.2%， the RSDs are in the range of 3.5%-6.0%. The method shows a quick， efficient， high purifying effect and high extraction rate for the target analytes， and can be used to extract pesticide residues in traditional Chinese medicine.
Keywords Panax ginseng C.A.Mey； Trzaine herbicides； Ionic liquid； Matrix solid phase dispersion； Ultrasonicassisted nebulization extraction； Solid phase extraction
摘 要 采用固载1甲基3己基咪唑六氟磷酸（[C6MIM][PF6]）的硅胶作为基质固相分散剂， 与超声雾化提取及C18固相萃取相结合，对人参提取物进行提取和净化； 采用高效液相色谱法，建立了人参中5种三嗪类除草剂的检测方法。样品前处理的最优条件为：300 mg人参粉末与150 mg硅胶（[C6MIM][PF6]含量2.0 mmol/g）研磨5 min，以20.0 mL去离子水（pH 7，含1.0% NaCl）超声雾化提取10 min，再以 5.0 mL 乙腈洗脱萃取小柱（300 mg C18）。实验结果表明，目标物的检出限为0.020～0.035 g/g，线性相关系数r2≥0.9992， 实际样品加标回收率为78.2%～95.4%，相对标准偏差为3.5%～6.0%。本方法快速高效、净化效果好、提取率高，为中药中农药残留的检测提供了新的样品前处理方法。
关键词 人参； 三嗪除草剂； 离子液体； 基质固相分散； 超声雾化； 固相萃取
20160124收稿；20160406接受
Email： jinyr@jlu.edu.cn
1 引 言
超声雾化提取（UANE）是基于超声辅助提取的一种新型提取方法，除具有超声辅助提取法所具有的空化效应、机械效应和热效应外，还具有喷泉效应，可利用产生的气溶胶和喷泉加速目标分析物的传质，便于与其它技术联用[1]，富集与净化可同时完成。目前，超声雾化提取技术主要应用于植物成分提取[2～8] 和农药残留物分析[9]等； 但存在雾化功率较小以及气溶胶分布不均匀等问题，稳定性略差且气溶胶的利用率较低，因此难以在农药残留分析中广泛应用。
三嗪类除草剂应用较广，在土壤和水体中残留时间较长，因此会污染人参种植地， 使人参带有三嗪除草剂。目前，针对三嗪类除草剂的检测方法比较成熟[10～13]，相关的样品前处理方法已有大量报道[14～16]。但是因为人参中成分复杂，采用高效液相分析三嗪除草剂时，检测波长与人参成分的吸收波长比较相近， 所以需要高效的前处理方法，以减少人参成分的干扰。
离子液体固载基质固相分散（ILMSPD）[17]是基于基质固相分散（MSPD）[18，19]发展起来的一种新的样品处理技术，具有提取率高、有机溶剂用量少的特点，但是存在操作过程繁琐、洗脱溶剂难于浓缩与定容等问题。为提高UANE的稳定性和样品净化效果，简化ILMSPD操作过程，缩短提取时间，同时实现目标物的提取、富集与净化，本实验采用固载离子液体的基质固相分散与超声雾化提取以及固相萃取相结合的方法提取人参中常用5种三嗪类除草剂，并利用高效液相色谱法测定其含量，建立了人参中三嗪类除草剂残留量的快速、准确、灵敏的分析方法。本方法可作为一种新的农药残留样品前处理方法，用于中药中农药残留的检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Aglient 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配Aglient 1200工作站、紫外检测器（VWD）。超声雾化提取装置（图1）由超声雾化加湿器（北京亚都科技有限公司）改造而成； 超声功率最大为35 W，频率为1.7 MHz； 超声雾化提取瓶内径6 cm，底端开口用PVC薄膜密封，顶端开口用于填加样品、提取液及安装固相萃取装置。
莠灭净（Ametryn）、阿特拉津（Atrazine）、敌草净（Desmetryn）、扑灭津（Propazine）和西玛津（Simazine）5种三嗪类除草剂标准品（纯度>99%，Dr. Ehrenshtofer公司）； 色谱级甲醇和乙腈（Sigmaalrich公司）； C18（200～300目，绿百草科技发展有限公司）； 硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）； 中性氧化铝（200～300目）和硅藻土（200～300目， 上海国药集团）； 固相萃取小柱及筛板（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。 3种离子液体： 1丁基3甲基咪唑六氟磷酸盐{[C4MIM][PF6]}、1甲基3己基咪唑六氟磷酸盐{[C6MIM][PF6]}、1甲基3辛基咪唑六氟磷酸盐{[C8MIM][PF6]}（纯度均大于98.0%，上海成捷化学有限公司）。其它试剂均购自北京化学试剂厂。
2.2 仪器条件
HPLC色谱分离条件： Aglient Zorbax SBC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30℃；流动相为乙腈（A）水（B）；流速0.8 mL/min；梯度洗脱：0～8 min，35%～50% A；8～15 min，50% A；15～20 min，50%～55% A；检测波长228 nm；进样量20 μL。
2.3 实验方法
将300 mg 人参粉末、200 μL去离子水和150 mg表面固载有[C6MIM][PF6]的硅胶一同研磨5 min，混合物转移至超声雾化提取瓶中，加入20.0 mL去离子水作为提取剂。将填装有300 mg已活化的C18固定相的固相萃取小柱安装到提取瓶上，连接真空泵。开启真空泵，打开提取器开关，调节功率至35 W，提取10 min； 取下固相萃取小柱，加入10 mL去离子水冲洗，以真空泵抽干，用6.0 mL乙腈洗脱，收集洗脱液，40℃减压蒸干； 加入200 μL甲醇复溶，过0.22 μm滤膜，进样高效液相色谱仪分析。
2.4 超声雾化固相萃取（UANESPE）
将300 mg加标样品粉末和20.0 mL去离子水加入超声雾化提取瓶中，后续操作过程同2.3节，仅提取时间调整为15 min。
2.5 硅胶基质固相分散超声雾化固相提取（SGMSPDUANESPE）
将300 mg 加标样品粉末、200 μL去离子水和150 mg硅胶研磨5 min，混合物转移至超声雾化提取瓶中，后续操作过程同2.3节。
2.6 基质固相分散（MSPD）
将300 mg 加标样品粉末、200 μL去离子水和150 mg表面固载有[C6MIM][PF6]的硅胶加入玛瑙研钵，研磨5 min。将粉末加入装有300 mg C18的固相萃取柱中，用20.0 mL去离子水淋洗，吹干，后续操作过程同2.3节。
3 结果与讨论
3.1 固化载体选择
按文献[20，21]的方法考察了4种固化载体：硅胶、中性氧化铝、硅藻土和C18。结果表明，硅胶对离子液体的固载效果最好，这与硅胶的比表面积较大及SiOH吸附作用力强有关，所以选择硅胶作为固化载体。
3.2 离子液体种类和吸附量的选择
硅胶表面固载离子液体方法采用直接浸渍法[20，21]。离子液体的烷烃链对提取存在影响，烷烃链长虽然有助于MSPD过程中小极性物质的提取，但是在UANE过程中，会增加提取液对固相萃取小柱的洗脱能力，降低分析物的回收率。实验结果表明，质量和固载浓度（0.0015 mol/g）相同，而烷烃链长度不同的离子液体（[C4MIM][PF6]，[C6MIM][PF6]，[C8MIM][PF6]）固载的硅胶中，[C6MIM][PF6]固载的硅胶对5种除草剂的回收率较高，故选择[C6MIM][PF6]。
离子液体的吸附量越多，同等质量的分散剂，固体成分越少，MSPD的提取效果越差，而UANE雾化效果越好，固载量由1.0～2.5 mmol/g的实验结果见图2a， 当离子液体的固载量为2.0 mmol/g时，分析物的回收率最高，因此离子液体固载量选择2.0 mmol/g。
3.3 分散剂的质量
在MSPD过程中，分散剂主要是破坏样品组织结构。但在超声雾化过程中，分散剂则会吸收超声波，减弱超声雾化提取的喷泉效应，阻碍气溶胶的形成。实验中考察了0.05～0.25 g分散剂对5种三嗪除草剂回收率的影响（图2b）。结果表明，分散剂质量为0.15 g时，分析物的回收率最高。因此，样品量为300 mg时，分散剂的质量选择为0.15 g。
3.4 pH值和离子强度的影响
考察了提取液pH值和离子强度对5种分析物回收率的影响。实验中使用HCl和NaOH调节溶液pH值。结果表明，当提取液pH值在6～7之间时，分析物的回收率较高，所以选择提取液pH值为7。
离子强度会影响分析物的回收率[22]，为防止引入其它离子，实验选择NaCl调节提取液的离子强度。结果表明，当NaCl的浓度为1%时，5种分析物的回收率最大，故选择提取液中的NaCl的浓度为1.0%。
3.5 固相萃取洗脱剂和体积的影响
因乙腈对人参中内源性物质溶解度较差，而对目标物洗脱效果较好，故选择乙腈作为洗脱剂，当乙腈体积超过5.0 mL时，目标物回收率变化不大，说明5.0 mL乙腈可以将目标物完全洗脱，所以洗脱体积选择5.0 mL。
3.6 工作曲线、检出限和定量限
按最优实验条件下提取不同加标浓度（0.10～20.00 μg/g）的人参加标样品，并进行高效液相分析，将得到的各目标分析物的峰面积对含量作图，绘制工作曲线，得到5种三嗪类除草剂回归方程和线性范围。按信噪比（S/N）为3和10测定各目标物的检出限和定量限，实验结果见表1，定量限色谱图见图3。
3.7 加标回收率和实际样品分析
采用本方法对购买的其它5个批次人参样品中的三嗪类除草剂进行检测，均未检出三嗪类除草剂。为了考察实际样品的基质效应，在人参中添加3个浓度水平（0.50， 5.00和15.00 μg/g）的除草剂，实验结果见表2，加标回收率为78.2%～95.4%，RSD为3.5%～6.0%。结果表明，本实验方法可以用于检测人参中的三嗪类除草剂。
3.8 方法对比
3水平（0.50， 5.00和15.00 μg/g）的加标样品按照2.4～2.6节方法进行处理，结果见表3。结果表明，基质固相分散超声雾化提取的回收率均高于单一使用超声雾化提取法或基质固相分散法，尤其是使用离子液体固载的硅胶作为分散剂时，目标物的回收率高于硅胶作为分散剂时的回收率。
4 结 论
本研究使用离子液体基质固相分散超声雾化固相萃取法提取人参中的5种三嗪类除草剂， 经考察相关影响因素，确立了最优提取条件，对6批次人参样品中的三嗪除草剂进行了检测。结果表明，与对比方法相比，本方法具有回收率高、操作简单、提取时间短等优点。本研究结果表明， 离子液体基质固相分散超声雾化固相萃取法可作为一种有效的中药中农药残留的提取方法。
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Abstract A new ultrasonicassisted nebulization extraction （UANE） method coupled with silicasupported ionic liquid based matrix solid phase dispersion（SSILbased MSPD） and solid phase extraction（SPE） was established for the extraction of five triazine herbicides from root of Panax ginseng C.A.Mey. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine these analytes. Experimental parameters， which affect the recoveries of the analytes， were studied and optimized. The sample powder （300 mg） was mixed with 150 mg of silica gel （[C6MIM][PF6] 2.0 mmol/g）. After MSPD for 5 min， the mixtures were extracted in water （pH 7， NaCl 1.0%） by UANE for 10 min， and then eluted by 5.0 mL of acetonitrile from the SPE column （C18， 300 mg）. Under the optimized conditions， the LODs of these five triazine herbicides are in the ranges of 0.020-0.035 μg/g， the concentration range of linear relationship of analytes （r2≥0.9992） are in the ranges of 0.15-20.00 μg/g. The recoveries of these five triazine herbicides are in the ranges of 78.2%-95.2%， the RSDs are in the range of 3.5%-6.0%. The method shows a quick， efficient， high purifying effect and high extraction rate for the target analytes， and can be used to extract pesticide residues in traditional Chinese medicine.
Keywords Panax ginseng C.A.Mey； Trzaine herbicides； Ionic liquid； Matrix solid phase dispersion； Ultrasonicassisted nebulization extraction； Solid phase extraction
