不同光谱预处理对激光诱导击穿光谱检测猪肉中铅含量的影响
陈添兵+刘木华+黄林+周华茂+王彩虹+杨晖+胡慧琴+姚明印
摘要 为了研究适合激光诱导击穿光谱（LIBS）检测猪肉中重金属铅（Pb）元素含量的光谱预处理方法，将配制的84个猪肉腿肌样品分为校正集和预测集，以相关系数（R）、内部交叉验证均方差（RMSECV）和预测均方根误差（RMSEP）作为评价指标，比较了5种光谱预处理方法对偏最小二乘法（PLS）建模预测效果的影响。结果表明，多元散射校正（MSC）预处理效果最好，定标模型预测值与实验室分析元素检测值的相关系数（R）达到0.9908，RMSECV为0.302，RMSEP为0.282，主成分数为16，18个预测集样品的验证结果的平均相对预测误差（ARPE）为7.8%。说明MSC是LIBS检测猪肉Pb含量的有效光谱预处理方法，该研究为进一步实现食品中重金属快速定量分析提供了方法和数据参考。
关键词 激光诱导击穿光谱； 光谱预处理； 偏最小二乘法； 重金属
2016-02-19收稿；2016-04-11接受
本文系国家自然科学基金（Nos.31460419、31560482）、江西省重大科技项目自然科学基金（No.20143ACB21013）、2014年江西省远航工程计划 （No.20140142） 和江西省学术带头人计划（No.09004004） 资助
E-mail： mingyin800@126. com
1 引 言
近些年来猪肉在中国肉类食品消费中一直占65%左右，人均年消费量近40 kg。某些商家为了促进猪、鸡、鸭等畜禽快速发育生长，在饲料中加入食品添加剂。已经在某些饲料中检测出Cu， Zn， Pb， Cr， Cd， As等重金属元素严重超标，从而导致重金属在猪体内富集，进而给猪肉消费者带来潜在的危害。众所周知，人食用含有重金属的猪肉后转移到体内，对人体的靶器官造成极大的损害，甚至有致畸致癌的危险。例如：Pb是对人体有害的元素，人食用了被Pb污染的猪肉食品后，可能会引起末梢神经炎，运动和感觉障碍等疾病[1，2]。在急慢性Pb中毒中，一般都会出现贫血现象，这是由于Pb元素引发发血红素合成障碍和红细胞寿命降低引起的。虽然适量重金属元素能够促进禽畜生长，但如果其重金属含量超标将会危害动物健康，进一步危害人类的健康。因此，为了人们可以食用放心肉，有效控制和快速检测出肉类食品中重金属含量是当前急需解决的问题之一。
激光诱导击穿光谱（Laser induced breakdown spectroscopy， LIBS ）是一种基于原子发射光谱和激光等离子体发射光谱进行样品中元素成分分析的光谱技术，它具有检测速度快、多元素同时检测、无需复杂的样品预处理及分析简便等优点，相比电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）、X射线荧光光谱（XFS）、原子吸收光谱（AAS）等化学方法而言，LIBS方法不需要进行复杂及周期长的化学消解过程，能通过现场实时采集的光谱信息快速诊断样品中分析元素的种类及含量，是一种绿色分析方法。目前，该技术已被广泛应用在环境监测[3，4]、生物医学[5，6]、文物鉴定[7，8]、材料成分分析[9，10]等领域中。但由于LIBS光谱信号存在激光诱导过程中产生的较强的连续背景噪声辐射，而且光谱仪在信号处理过程中会带来光/电信号及模/数信号转换的附加噪声，这些噪声会影响分析元素的光谱强度。为了更准确、有效的获得有效的实验数据，需要对光谱数据进行预处理。邹孝恒等[11]将遗传算法（GA）作为一种谱线选择的预处理方法，结合PLS模型，采用激光诱导击穿光谱技术对土壤成分进行检测，结果表明，GA-PLS模型能够显著改善传统PLS模型的预测能力。黎文兵等[12]采用13点平滑和中心化方法对脐橙中Cu元素的LIBS光谱信号进行预处理，结果表明，该预处理方法能效提高LIBS检测脐橙PLS定量模型的预测精度。杨崇瑞等[13]提出基于分段光谱特征值提取法和小波变换算法等多个数据预处理方法对LIBS技术中光谱信号进行处理，研究结果表明，该方法能有效提高谱线分析和识别的质量。
此外，LIBS光谱通常是在激光作用物质后数μs甚至几百ns开始采集信息，并且激光诱导等离子体烧蚀、产生、膨胀及冷却的各个过程中， 其温度和电子数密度都在迅速变化，导致待分析元素光谱信号容易受到其它元素谱线干扰。因此，采用传统的一元定标法常无法满足定量分析要求，而多变量分析能更充分利用光谱中的信息，有利于校正基体效应和谱线之间的干扰。将多元线性定标[14～16]、偏最小二乘法[17～19]及主成分分析法[20]等多变量分析方法应用于LIBS检测技术， 能较好地提高定量分析能力。
前人的研究对LIBS光谱数据处理及定标分析方法提供了极具价值的参考，但对于基体复杂的农产品的研究较少。为此，本研究选用不同铅含量的84个猪腿肌肉样品，在相同条件下，进行激光诱导击穿光谱实验，对比了标准归一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、均值中心化（MC）、一阶导数（FD）和二阶导数（SD）5种不同的光谱数据预处理方法对定量模型的影响，并建立基于多变量分析的偏最小二乘法铅含量的定标模型，为探讨LIBS技术快速检测猪肉中重金属含量提供一种新途径。
2 实验部分
2.1 实验装置
实验装置系统原理如图1所示，采用Vlite-200型Nd∶YAG激光器作为激发光源 （北京镭宝公司），工作波长1064 nm， 单脉冲最大能量300 mJ， 脉冲宽度8 ns。激光束经反射镜垂直后，透过穿孔反射镜经焦距为100 mm的聚焦透镜聚焦在待测样品表面。产生的激光等离子体光谱信号经过穿孔反射镜（镀紫外加强铝膜，反射率达80%以上）反射到焦距为100 mm的石英透镜耦合至光纤，传输至光谱仪完成光谱的分光与光电转换，其中AvaSpec-uls2048-2型光谱仪（荷兰爱万提斯公司）测量波长为210～473 nm，主通道210～362 nm，分辨率0.08～0.11 nm；通道324～473 nm的分辨率0.10～0.16 nm；探测器为ILX554B型线阵CCD，2048像素，光谱仪最小积分时间为2 ms。样品置于二维旋转工作台上，匀速运动实现无重复采样打点，以保证样品测量的均匀性和稳定性。DG645型数字式延迟脉冲发生器（美国斯坦福研究系统公司）为激光器和光谱仪提供精准外触发信号，调整激光等离子产生与光谱仪采集之间的时间差，以获取信噪比较高的等离子体光谱信号。本实验设定延时时间为1.1 μs，激光能量为110 mJ， 重复频率为2 Hz，光谱仪积分时间为2 ms。
2.2 样品制备
从某农贸市场购买新鲜的猪腿肌肉（均为瘦肉），将其分成等量（约为5 g）的84份样品。为了验证LIBS检测猪肉中重金属Pb元素的可行性，需要对猪肉样品进行不同浓度梯度的实验室污染处理。将配置好不同浓度的Pb（NO3）2溶液对样品进行浸泡处理，然后清洗、烘干、粉碎，并用手动压片机对样品进行压片制样（压力为20 MPa），每个样品制成直径为30 mm，厚度约为5 mm的圆饼块状型。待LIBS光谱采集实验后，采用国家标准规定的湿法消解法对每个样品进行消解，再采用原子吸收光谱法（AAS）对消解液进行检测，每个样品铅元素的真实含量如表1所示，其中1～4号是未污染原始样品，5～84号为污染样品，共配制了84个样品。根据食品安全国家标准《食品中污染物限量GB2762-2012》规定肉类食品中铅含量不得超过0.2 μg/g，可以看出，未经实验室污染处理的原始样品符合国家食品安全标准，而污染处理后的样品均超过了国家规定的限量值。
3 结果与讨论
3.1 光谱预处理
由84个猪肉样品的原始激光诱导等离子体平均光谱图（图2）可见，LIBS光谱图存在较大差异，且图谱不光滑，存在噪音。为了准确分析样品的物质成分，必须对原始LIBS光谱进行预处理，以降低噪声，减少或消除各种环境、基体效应等因素的影响，提高检测分辨率和灵敏度。光谱预处理方法很多不同光谱预处理方式建立的定标模型结果存在差异。根据美国国家标准与技术研究院（NIST）数据库可知，Pb元素在405.78 nm处谱线发射强度最大，且灵敏度高，选用Pb I 405.78 nm为分析线，图2显示了有特征峰值的区域主要在波段370～430 nm范围内，即该波段主要反映了猪肉中元素的信息。因此，本实验选用包含Pb I 405.78 nm特征光谱在内的波段370～430 nm原始光谱作为预处理对象。利用Matlab7.8软件分别采用标准归一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、均值中心化（MC）、一阶导数（FD）和二阶导数（SD）5种方法对波段370～430 nm原始光谱进行预处理。SNV是对每条光谱进行标准化处理的方法，可以消除量纲影响和变量自身变异大小及数值大小的影响；MSC是经过散射校正后得到的光谱数据，先将所有样品的等离子体光谱的平均光谱作为标准光谱，然后每个样品的光谱与标准光谱进行一元线性回归运算，求得各光谱相对于标准光谱的线性平移量（回归常数）和倾斜偏移量（回归系数），在每个样品原始光谱中减去线性平移量同时除以回归系数修正光谱的基线相对倾斜，这样每个光谱的基线平移和偏移都在标准光谱的参考下予以修正，而样品成分含量所对应的光谱吸收信息在数据处理的全过程中没有任何影响，所以提高了光谱的信噪比；MC是将每个仪器所获取数据矩阵的平均能量去除，消除了指标量纲和数量的影响；光谱的FD和SD是光谱分析中常用的基线校正和光谱分辨预处理方法；对光谱进行求导可以有效减少噪声信号的影响，提高信噪比。
3.2 PLS模型主成分数确认
在偏最小二乘法中，主成分个数的选择至关重要。主成分个数选择过多会导致过拟合，将一些噪声的主成分加到模型中，可能会导致拟合效果很好的表象，而预测效果却很不理想；主成分个数选择过少，则不能完全反映未知样品被测组分产生的测量光谱数据变化，会使拟合效果和预测效果均不理想。本研究中，以内部交叉验证均方差（RMSECV）为评价指标，针对不同预处理方法，比较了不同主成分数下的PLS模型效果，以SNV预处理为例，RMSECV随主成分个数的变化情况如图3所示。主成分个数为15时，RMSECV值最小，所以选用主成分数为15时建立PLS定标模型。其它4种预处理方法按同样的方式选出最佳主成分个数，最终分别优化不同光谱预处理的最佳主成分数如表2。
3.3 预测模型的建立与结果对比分析
按样品含铅浓度从低到高编号，从中等间隔（步长为4）分成4组，即y1组取出1，5，9…….81号样品， y2组取出2，6，10…….82样品，y3组取出3，7，11…….83样品，y4组取出4，8，12…….84样品；其中y1，y2，y4为训练集（63个样品），y3组为预测集（21个样品）。将预处理后对应的光谱区间内的所有强度值作为PLS的自变量，铅元素浓度作为因变量，并根据不同预处理方法的最佳主成分数，采用训练集分别建立PLS定标模型，图4为原始光谱经过各种预处理后基于PLS法建模计算得到的猪肉铅含量预测值与AAS检测值的相关图，模型预测结果见表2。
由表2可知，不同预处理方法对所建立的PLS定标模型结果有所差异。其中多元散射校正（MSC）预处理相关系数（R）最大，内部交叉验证均方差（RMSECV）和预测均方根误差（RMSEP）最小；一阶导数（FD）预处理相关系数（R）最小，内部交叉验证均方差（RMSECV）最大。因此，在5种光谱预处理方法中，多元散射校正（MSC）可确认为是LIBS结合偏最小二乘法检测猪肉中铅元素含量的最佳预处理方法。根据MSC预处理后的PLS定标模型对y3组的铅含量进行回归预测，其预测结果与采用实验室AAS检测的参考值之间的对比如图5所示，在回归预测结果中，由于前3个样品铅含量实际浓度小（<1 μg/g），导致相对误差较大，其它18个预测样品的平均相对预测（ARPE）误差为7.8%。说明采用基于多元散射校正（MSC）的偏最小二乘法能得到较好的测量精度，预测得到的值与实验室AAS检测值相吻合。
4 结 论
本研究利用激光诱导击穿光谱（LIBS）结合偏最小二乘法（PLS）检测猪肉中重金属铅含量的定量分析。为了更准确分析待测样品的物质含量，以降低噪音，减少或消除基体效应及环境因素等非目标因素的影响，分别采用了标准归一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、均值中心化（MC）、一阶导数（FD）和二阶导数（SD）5种光谱预处理方法对84个样品原始LIBS光谱进行了预处理；同时，为了保证建立的PLS定量分析模型的可靠性，采用了内部交叉验证均方差对PLS模型进行检验，确定最佳的PLS主成分数。结果表明，多元散射校正（MSC）预处理后所建的PLS模型效果最佳，其预测精度最好，最佳主成分数为16。
References
1 XUE Shu-Min. Agriculture and Technology， 2013， 33（6）： 156-157
薛书民. 农业与技术， 2013， 33（6）： 156-157
2 Pelfrêne A， Douay F， Richard A， Roussel H， Girondelot B. Environ. Monitor. Assess.， 2013， 185（4）： 2999-3012
3 Dell′Aglio M， Gaudiuso R， Senesi G S， de Giacomo A， Zaccone C， Miano T M， de Pascale O. J. Environ. Monit.， 2011， 13（5）： 1422-1426
4 El Haddad J， Villot-Kadri M， Ismael A， Gallou G， Michel K， Bruyère D， Bousquet B. Spectrochim. Acta B， 2013， 79： 51-57
5 Hrdlika A， Proke L， Staňkov A， Novotny K， Viteníkov A， Kanicky V， Pleníkov K. Appl. Optics， 2010， 49（13）： C16-C20
6 Baudelet M， Yu J， Bossu M， Jovelet J， Wolf J. P， Amodeo T， Laloi P. Appl. Phys. Lett.， 2006， 89（16）： 163903
7 Ramil A， López A. J， Yez A. Applied Physics A， 2008， 92（1）： 197-202
8 de Giacomo A， Dell′Aglio M， de Pascale O， Gaudiuso R， Santagata A， Teghil R. Spectrochim. Acta B， 2008， 63（5）： 585-590
9 Anzano J， Bonilla B， Montull-Ibor B， Casas-Gonzlez J. Med. Chem. Res.， 2009， 18（8）： 656-664
10 LIU Kai， WANG Qian-Qian， ZHAO Hua， XIAO Yin-Long. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2011， 31（5）： 1171-1174
刘 凯， 王茜蒨， 赵 华， 肖银龙. 光谱学与光谱分析， 2011， 31（5）： 1171-1174
11 ZOU Xiao-Heng， HAO Zhong-Qi， YI Rong-Xing， GUO Lian-Bo， SHEN Meng， LI Xiang-You， WANG Ze-Min， ZENG Xiao-Yan， LU Yong-Feng. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（3）： 181-186
邹孝恒， 郝中骐， 易荣兴， 郭连波， 沈 萌， 李祥友， 王泽敏， 曾晓雁， 陆永枫. 分析化学， 2015， 43（3）： 181-186
12 LI Wen-Bing， YAO Lin-Tao， LIU Mu-Hua， HUANG Lin， YAO Ming-Yin， CHEN Tian-Bing， HE Xiu-Wen， YANG Ping， HU Hui-Qin， NIE Jiang-Hui. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2015， 35（5）： 1392-1397
黎文兵， 药林桃， 刘木华， 黄 林， 姚明印， 陈添兵， 何秀文， 杨 平， 胡慧琴， 聂江辉.光谱学与光谱分析， 2015， 35（5）： 1392-1397
13 YANG Chong-Rui， WANG Jia-Sheng， SHENG Xin-Zhi， LOU Shu-Qin. Infrared and Laser Engineering， 2014， 43（11）： 3807-3812
杨崇瑞， 汪家升， 盛新志， 娄淑琴. 红外与激光工程， 2014， 43（11）： 3807-3812
14 Ayyalasomayajula K. K， Yu-Yueh F， Singh J. P， McIntyre D. L， Jain J. Appl. Optics， 2012， 51（7）： B149-B154
15 DONG Mei-Rong， LU Ji-Dong， YAO Shun-Chun， CHEN Kai， LI Jun， LI Jun-Yan. Journal of Engineering Thermophysics， 2012， 33（1）： 175-179
董美蓉， 陆继东， 姚顺春， 陈 凯， 李 军， 李俊彦. 工程热物理学报， 2012， 33（1）： 175-179
16 Laville S， Sabsabi M， Doucet F R. Spectrochim. Acta B， 2007， 62（12）： 1557-1566
17 Wang Z，Feng J， Li L， Ni W， Li Z. J. Anal. At. Spectrom.， 2011， 26（11）： 2175-2182
18 Feng J， Wang Z， West L， Li Z， Ni W. Anal. Bioanal. Chem.， 2011， 400（10）： 3261-3271
19 Andrade J. M，Cristoforetti G， Legnaioli S， Lorenzetti G， Palleschi V， Shaltout A. Spectrochim. Acta B， 2010， 65（8）： 658-663
20 Clegg S M，Sklute E， Dyar M D， Barefield J E， Wiens R C. Spectrochim. Acta B， 2009， 64（1）： 79-88
Abstract To search an optimum spectral pretreatment method to measure Pb content in the leg muscle of pork with laser-induced breakdown spectroscopy， a total of 84 pork samples were split into calibration and prediction sets. With correlation coefficient （R）， root-mean-square error of cross-validation （RMSECV） and root-mean-square error of predictionas （RMSEP） as the evaluation index， the effect of five pretreatment methods to the model based on partial least square （PLS） were compared. The results showed that the multiplicative scatter correction （MSC） was most effective and its R， RMSECV， RMSEP and principal element were 0.9908， 0.302， 0.282 and 16， respectively. The average relative error of prediction sets of 18 samples was 7.8%. The MSC is an efficient method to measure Pb in pork with laser-induced breakdown spectroscopy. The research provides an approach for further improving the accuracy of LIBS quantitative analysis of heavy metals in food.
Keywords Laser-induced breakdown spectroscopy； Spectral pretreatment； Partial least square； Heavy metals
摘要 为了研究适合激光诱导击穿光谱（LIBS）检测猪肉中重金属铅（Pb）元素含量的光谱预处理方法，将配制的84个猪肉腿肌样品分为校正集和预测集，以相关系数（R）、内部交叉验证均方差（RMSECV）和预测均方根误差（RMSEP）作为评价指标，比较了5种光谱预处理方法对偏最小二乘法（PLS）建模预测效果的影响。结果表明，多元散射校正（MSC）预处理效果最好，定标模型预测值与实验室分析元素检测值的相关系数（R）达到0.9908，RMSECV为0.302，RMSEP为0.282，主成分数为16，18个预测集样品的验证结果的平均相对预测误差（ARPE）为7.8%。说明MSC是LIBS检测猪肉Pb含量的有效光谱预处理方法，该研究为进一步实现食品中重金属快速定量分析提供了方法和数据参考。
关键词 激光诱导击穿光谱； 光谱预处理； 偏最小二乘法； 重金属
2016-02-19收稿；2016-04-11接受
本文系国家自然科学基金（Nos.31460419、31560482）、江西省重大科技项目自然科学基金（No.20143ACB21013）、2014年江西省远航工程计划 （No.20140142） 和江西省学术带头人计划（No.09004004） 资助
E-mail： mingyin800@126. com
1 引 言
近些年来猪肉在中国肉类食品消费中一直占65%左右，人均年消费量近40 kg。某些商家为了促进猪、鸡、鸭等畜禽快速发育生长，在饲料中加入食品添加剂。已经在某些饲料中检测出Cu， Zn， Pb， Cr， Cd， As等重金属元素严重超标，从而导致重金属在猪体内富集，进而给猪肉消费者带来潜在的危害。众所周知，人食用含有重金属的猪肉后转移到体内，对人体的靶器官造成极大的损害，甚至有致畸致癌的危险。例如：Pb是对人体有害的元素，人食用了被Pb污染的猪肉食品后，可能会引起末梢神经炎，运动和感觉障碍等疾病[1，2]。在急慢性Pb中毒中，一般都会出现贫血现象，这是由于Pb元素引发发血红素合成障碍和红细胞寿命降低引起的。虽然适量重金属元素能够促进禽畜生长，但如果其重金属含量超标将会危害动物健康，进一步危害人类的健康。因此，为了人们可以食用放心肉，有效控制和快速检测出肉类食品中重金属含量是当前急需解决的问题之一。
激光诱导击穿光谱（Laser induced breakdown spectroscopy， LIBS ）是一种基于原子发射光谱和激光等离子体发射光谱进行样品中元素成分分析的光谱技术，它具有检测速度快、多元素同时检测、无需复杂的样品预处理及分析简便等优点，相比电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）、X射线荧光光谱（XFS）、原子吸收光谱（AAS）等化学方法而言，LIBS方法不需要进行复杂及周期长的化学消解过程，能通过现场实时采集的光谱信息快速诊断样品中分析元素的种类及含量，是一种绿色分析方法。目前，该技术已被广泛应用在环境监测[3，4]、生物医学[5，6]、文物鉴定[7，8]、材料成分分析[9，10]等领域中。但由于LIBS光谱信号存在激光诱导过程中产生的较强的连续背景噪声辐射，而且光谱仪在信号处理过程中会带来光/电信号及模/数信号转换的附加噪声，这些噪声会影响分析元素的光谱强度。为了更准确、有效的获得有效的实验数据，需要对光谱数据进行预处理。邹孝恒等[11]将遗传算法（GA）作为一种谱线选择的预处理方法，结合PLS模型，采用激光诱导击穿光谱技术对土壤成分进行检测，结果表明，GA-PLS模型能够显著改善传统PLS模型的预测能力。黎文兵等[12]采用13点平滑和中心化方法对脐橙中Cu元素的LIBS光谱信号进行预处理，结果表明，该预处理方法能效提高LIBS检测脐橙PLS定量模型的预测精度。杨崇瑞等[13]提出基于分段光谱特征值提取法和小波变换算法等多个数据预处理方法对LIBS技术中光谱信号进行处理，研究结果表明，该方法能有效提高谱线分析和识别的质量。
此外，LIBS光谱通常是在激光作用物质后数μs甚至几百ns开始采集信息，并且激光诱导等离子体烧蚀、产生、膨胀及冷却的各个过程中， 其温度和电子数密度都在迅速变化，导致待分析元素光谱信号容易受到其它元素谱线干扰。因此，采用传统的一元定标法常无法满足定量分析要求，而多变量分析能更充分利用光谱中的信息，有利于校正基体效应和谱线之间的干扰。将多元线性定标[14～16]、偏最小二乘法[17～19]及主成分分析法[20]等多变量分析方法应用于LIBS检测技术， 能较好地提高定量分析能力。
前人的研究对LIBS光谱数据处理及定标分析方法提供了极具价值的参考，但对于基体复杂的农产品的研究较少。为此，本研究选用不同铅含量的84个猪腿肌肉样品，在相同条件下，进行激光诱导击穿光谱实验，对比了标准归一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、均值中心化（MC）、一阶导数（FD）和二阶导数（SD）5种不同的光谱数据预处理方法对定量模型的影响，并建立基于多变量分析的偏最小二乘法铅含量的定标模型，为探讨LIBS技术快速检测猪肉中重金属含量提供一种新途径。
2 实验部分
2.1 实验装置
实验装置系统原理如图1所示，采用Vlite-200型Nd∶YAG激光器作为激发光源 （北京镭宝公司），工作波长1064 nm， 单脉冲最大能量300 mJ， 脉冲宽度8 ns。激光束经反射镜垂直后，透过穿孔反射镜经焦距为100 mm的聚焦透镜聚焦在待测样品表面。产生的激光等离子体光谱信号经过穿孔反射镜（镀紫外加强铝膜，反射率达80%以上）反射到焦距为100 mm的石英透镜耦合至光纤，传输至光谱仪完成光谱的分光与光电转换，其中AvaSpec-uls2048-2型光谱仪（荷兰爱万提斯公司）测量波长为210～473 nm，主通道210～362 nm，分辨率0.08～0.11 nm；通道324～473 nm的分辨率0.10～0.16 nm；探测器为ILX554B型线阵CCD，2048像素，光谱仪最小积分时间为2 ms。样品置于二维旋转工作台上，匀速运动实现无重复采样打点，以保证样品测量的均匀性和稳定性。DG645型数字式延迟脉冲发生器（美国斯坦福研究系统公司）为激光器和光谱仪提供精准外触发信号，调整激光等离子产生与光谱仪采集之间的时间差，以获取信噪比较高的等离子体光谱信号。本实验设定延时时间为1.1 μs，激光能量为110 mJ， 重复频率为2 Hz，光谱仪积分时间为2 ms。
2.2 样品制备
从某农贸市场购买新鲜的猪腿肌肉（均为瘦肉），将其分成等量（约为5 g）的84份样品。为了验证LIBS检测猪肉中重金属Pb元素的可行性，需要对猪肉样品进行不同浓度梯度的实验室污染处理。将配置好不同浓度的Pb（NO3）2溶液对样品进行浸泡处理，然后清洗、烘干、粉碎，并用手动压片机对样品进行压片制样（压力为20 MPa），每个样品制成直径为30 mm，厚度约为5 mm的圆饼块状型。待LIBS光谱采集实验后，采用国家标准规定的湿法消解法对每个样品进行消解，再采用原子吸收光谱法（AAS）对消解液进行检测，每个样品铅元素的真实含量如表1所示，其中1～4号是未污染原始样品，5～84号为污染样品，共配制了84个样品。根据食品安全国家标准《食品中污染物限量GB2762-2012》规定肉类食品中铅含量不得超过0.2 μg/g，可以看出，未经实验室污染处理的原始样品符合国家食品安全标准，而污染处理后的样品均超过了国家规定的限量值。
3 结果与讨论
3.1 光谱预处理
由84个猪肉样品的原始激光诱导等离子体平均光谱图（图2）可见，LIBS光谱图存在较大差异，且图谱不光滑，存在噪音。为了准确分析样品的物质成分，必须对原始LIBS光谱进行预处理，以降低噪声，减少或消除各种环境、基体效应等因素的影响，提高检测分辨率和灵敏度。光谱预处理方法很多不同光谱预处理方式建立的定标模型结果存在差异。根据美国国家标准与技术研究院（NIST）数据库可知，Pb元素在405.78 nm处谱线发射强度最大，且灵敏度高，选用Pb I 405.78 nm为分析线，图2显示了有特征峰值的区域主要在波段370～430 nm范围内，即该波段主要反映了猪肉中元素的信息。因此，本实验选用包含Pb I 405.78 nm特征光谱在内的波段370～430 nm原始光谱作为预处理对象。利用Matlab7.8软件分别采用标准归一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、均值中心化（MC）、一阶导数（FD）和二阶导数（SD）5种方法对波段370～430 nm原始光谱进行预处理。SNV是对每条光谱进行标准化处理的方法，可以消除量纲影响和变量自身变异大小及数值大小的影响；MSC是经过散射校正后得到的光谱数据，先将所有样品的等离子体光谱的平均光谱作为标准光谱，然后每个样品的光谱与标准光谱进行一元线性回归运算，求得各光谱相对于标准光谱的线性平移量（回归常数）和倾斜偏移量（回归系数），在每个样品原始光谱中减去线性平移量同时除以回归系数修正光谱的基线相对倾斜，这样每个光谱的基线平移和偏移都在标准光谱的参考下予以修正，而样品成分含量所对应的光谱吸收信息在数据处理的全过程中没有任何影响，所以提高了光谱的信噪比；MC是将每个仪器所获取数据矩阵的平均能量去除，消除了指标量纲和数量的影响；光谱的FD和SD是光谱分析中常用的基线校正和光谱分辨预处理方法；对光谱进行求导可以有效减少噪声信号的影响，提高信噪比。
3.2 PLS模型主成分数确认
在偏最小二乘法中，主成分个数的选择至关重要。主成分个数选择过多会导致过拟合，将一些噪声的主成分加到模型中，可能会导致拟合效果很好的表象，而预测效果却很不理想；主成分个数选择过少，则不能完全反映未知样品被测组分产生的测量光谱数据变化，会使拟合效果和预测效果均不理想。本研究中，以内部交叉验证均方差（RMSECV）为评价指标，针对不同预处理方法，比较了不同主成分数下的PLS模型效果，以SNV预处理为例，RMSECV随主成分个数的变化情况如图3所示。主成分个数为15时，RMSECV值最小，所以选用主成分数为15时建立PLS定标模型。其它4种预处理方法按同样的方式选出最佳主成分个数，最终分别优化不同光谱预处理的最佳主成分数如表2。
3.3 预测模型的建立与结果对比分析
按样品含铅浓度从低到高编号，从中等间隔（步长为4）分成4组，即y1组取出1，5，9…….81号样品， y2组取出2，6，10…….82样品，y3组取出3，7，11…….83样品，y4组取出4，8，12…….84样品；其中y1，y2，y4为训练集（63个样品），y3组为预测集（21个样品）。将预处理后对应的光谱区间内的所有强度值作为PLS的自变量，铅元素浓度作为因变量，并根据不同预处理方法的最佳主成分数，采用训练集分别建立PLS定标模型，图4为原始光谱经过各种预处理后基于PLS法建模计算得到的猪肉铅含量预测值与AAS检测值的相关图，模型预测结果见表2。
由表2可知，不同预处理方法对所建立的PLS定标模型结果有所差异。其中多元散射校正（MSC）预处理相关系数（R）最大，内部交叉验证均方差（RMSECV）和预测均方根误差（RMSEP）最小；一阶导数（FD）预处理相关系数（R）最小，内部交叉验证均方差（RMSECV）最大。因此，在5种光谱预处理方法中，多元散射校正（MSC）可确认为是LIBS结合偏最小二乘法检测猪肉中铅元素含量的最佳预处理方法。根据MSC预处理后的PLS定标模型对y3组的铅含量进行回归预测，其预测结果与采用实验室AAS检测的参考值之间的对比如图5所示，在回归预测结果中，由于前3个样品铅含量实际浓度小（<1 μg/g），导致相对误差较大，其它18个预测样品的平均相对预测（ARPE）误差为7.8%。说明采用基于多元散射校正（MSC）的偏最小二乘法能得到较好的测量精度，预测得到的值与实验室AAS检测值相吻合。
4 结 论
本研究利用激光诱导击穿光谱（LIBS）结合偏最小二乘法（PLS）检测猪肉中重金属铅含量的定量分析。为了更准确分析待测样品的物质含量，以降低噪音，减少或消除基体效应及环境因素等非目标因素的影响，分别采用了标准归一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、均值中心化（MC）、一阶导数（FD）和二阶导数（SD）5种光谱预处理方法对84个样品原始LIBS光谱进行了预处理；同时，为了保证建立的PLS定量分析模型的可靠性，采用了内部交叉验证均方差对PLS模型进行检验，确定最佳的PLS主成分数。结果表明，多元散射校正（MSC）预处理后所建的PLS模型效果最佳，其预测精度最好，最佳主成分数为16。
References
1 XUE Shu-Min. Agriculture and Technology， 2013， 33（6）： 156-157
薛书民. 农业与技术， 2013， 33（6）： 156-157
2 Pelfrêne A， Douay F， Richard A， Roussel H， Girondelot B. Environ. Monitor. Assess.， 2013， 185（4）： 2999-3012
3 Dell′Aglio M， Gaudiuso R， Senesi G S， de Giacomo A， Zaccone C， Miano T M， de Pascale O. J. Environ. Monit.， 2011， 13（5）： 1422-1426
4 El Haddad J， Villot-Kadri M， Ismael A， Gallou G， Michel K， Bruyère D， Bousquet B. Spectrochim. Acta B， 2013， 79： 51-57
5 Hrdlika A， Proke L， Staňkov A， Novotny K， Viteníkov A， Kanicky V， Pleníkov K. Appl. Optics， 2010， 49（13）： C16-C20
6 Baudelet M， Yu J， Bossu M， Jovelet J， Wolf J. P， Amodeo T， Laloi P. Appl. Phys. Lett.， 2006， 89（16）： 163903
7 Ramil A， López A. J， Yez A. Applied Physics A， 2008， 92（1）： 197-202
8 de Giacomo A， Dell′Aglio M， de Pascale O， Gaudiuso R， Santagata A， Teghil R. Spectrochim. Acta B， 2008， 63（5）： 585-590
9 Anzano J， Bonilla B， Montull-Ibor B， Casas-Gonzlez J. Med. Chem. Res.， 2009， 18（8）： 656-664
10 LIU Kai， WANG Qian-Qian， ZHAO Hua， XIAO Yin-Long. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2011， 31（5）： 1171-1174
刘 凯， 王茜蒨， 赵 华， 肖银龙. 光谱学与光谱分析， 2011， 31（5）： 1171-1174
11 ZOU Xiao-Heng， HAO Zhong-Qi， YI Rong-Xing， GUO Lian-Bo， SHEN Meng， LI Xiang-You， WANG Ze-Min， ZENG Xiao-Yan， LU Yong-Feng. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（3）： 181-186
邹孝恒， 郝中骐， 易荣兴， 郭连波， 沈 萌， 李祥友， 王泽敏， 曾晓雁， 陆永枫. 分析化学， 2015， 43（3）： 181-186
12 LI Wen-Bing， YAO Lin-Tao， LIU Mu-Hua， HUANG Lin， YAO Ming-Yin， CHEN Tian-Bing， HE Xiu-Wen， YANG Ping， HU Hui-Qin， NIE Jiang-Hui. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2015， 35（5）： 1392-1397
黎文兵， 药林桃， 刘木华， 黄 林， 姚明印， 陈添兵， 何秀文， 杨 平， 胡慧琴， 聂江辉.光谱学与光谱分析， 2015， 35（5）： 1392-1397
13 YANG Chong-Rui， WANG Jia-Sheng， SHENG Xin-Zhi， LOU Shu-Qin. Infrared and Laser Engineering， 2014， 43（11）： 3807-3812
杨崇瑞， 汪家升， 盛新志， 娄淑琴. 红外与激光工程， 2014， 43（11）： 3807-3812
14 Ayyalasomayajula K. K， Yu-Yueh F， Singh J. P， McIntyre D. L， Jain J. Appl. Optics， 2012， 51（7）： B149-B154
15 DONG Mei-Rong， LU Ji-Dong， YAO Shun-Chun， CHEN Kai， LI Jun， LI Jun-Yan. Journal of Engineering Thermophysics， 2012， 33（1）： 175-179
董美蓉， 陆继东， 姚顺春， 陈 凯， 李 军， 李俊彦. 工程热物理学报， 2012， 33（1）： 175-179
16 Laville S， Sabsabi M， Doucet F R. Spectrochim. Acta B， 2007， 62（12）： 1557-1566
17 Wang Z，Feng J， Li L， Ni W， Li Z. J. Anal. At. Spectrom.， 2011， 26（11）： 2175-2182
18 Feng J， Wang Z， West L， Li Z， Ni W. Anal. Bioanal. Chem.， 2011， 400（10）： 3261-3271
19 Andrade J. M，Cristoforetti G， Legnaioli S， Lorenzetti G， Palleschi V， Shaltout A. Spectrochim. Acta B， 2010， 65（8）： 658-663
20 Clegg S M，Sklute E， Dyar M D， Barefield J E， Wiens R C. Spectrochim. Acta B， 2009， 64（1）： 79-88
Abstract To search an optimum spectral pretreatment method to measure Pb content in the leg muscle of pork with laser-induced breakdown spectroscopy， a total of 84 pork samples were split into calibration and prediction sets. With correlation coefficient （R）， root-mean-square error of cross-validation （RMSECV） and root-mean-square error of predictionas （RMSEP） as the evaluation index， the effect of five pretreatment methods to the model based on partial least square （PLS） were compared. The results showed that the multiplicative scatter correction （MSC） was most effective and its R， RMSECV， RMSEP and principal element were 0.9908， 0.302， 0.282 and 16， respectively. The average relative error of prediction sets of 18 samples was 7.8%. The MSC is an efficient method to measure Pb in pork with laser-induced breakdown spectroscopy. The research provides an approach for further improving the accuracy of LIBS quantitative analysis of heavy metals in food.
Keywords Laser-induced breakdown spectroscopy； Spectral pretreatment； Partial least square； Heavy metals
