重金属Hg2+对毛蚶的急性毒性及肝脏组织结构的影响

    张艳红+郭旭东+崔健斌+刘丽东

    

    摘 要：在水溫（12±0.5）℃、盐度27‰的环境下，研究了重金属Hg2+对毛蚶的急性毒性效应和肝脏组织结构的影响。结果表明，Hg2+对毛蚶24、48、96 h LC50分别为9.23、5.43和2.07 mg/L；安全浓度分别为0.09、0.05和 0.02 mg/L。通过对Hg2+暴露在不同浓度96 h的毛蚶肝脏组织切片观察发现，Hg2+对毛蚶的肝脏组织结构有明显影响，肝脏的损伤程度随着Hg2+浓度的增加而加深，2.91 mg/L为毛蚶肝脏解毒的阈值。

    关键词：重金属；毛蚶；急性毒性；肝脏

    毛蚶（Scapharca subcrenata）属软体动物门，双壳纲，列齿目，蚶科，是我国沿海地区一种重要的经济贝类，通常生活在含泥沙较多的潮间带，在我国南北沿海均有分布，因其肉质鲜美，营养价值高，深受国内外消费者的欢迎。近几年，我国沿海地区的经济发展速度较快，随之而来的是大量工业废水和生活污水排入海洋，给海洋生态环境带来极大的负担，在诸多污染物中，重金属对海洋环境的影响尤为显著[1]。重金属随沿岸径流排入海中后，容易在沿海的底泥中沉积，而毛蚶为生活在泥沙中的底栖生物，又具有移动性差的特点，因而最易受到重金属的影响；重金属污染物可以在海洋生物体内或其某一组织中积累，通过生物富集和放大，直接或间接威胁人类的健康[2]。在利用生物间的共生互补原理、运用生态学原理创建环境友好型养殖模式中，底栖贝类是一个重要的混养组合，通过贝类消耗掉其它养殖动物所排出的N，可以优化养殖环境，同时增加养殖效益，例如海蜇、牙鲆和毛蚶的池塘立体生态混养。国内外已进行过许多有关重金属对鱼类及底栖贝类的急性毒性研究，但有关重金属Hg2+对毛蚶的急性毒性效应和肝脏组织结构的影响尚未见报道。笔者研究了Hg2+对毛蚶成贝的急性毒性效应，得出了24、48和96 h半致死浓度和安全质量浓度；同时研究了暴露Hg2+不同浓度96 h的情况下，对毛蚶肝脏组织结构的影响。本实验可为毛蚶安全养殖和重金属生态毒理学研究提供基础性数据。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    实验对象为成体毛蚶，产地河北省黄骅市。毛蚶进入实验室后，暂养5 d，期间定期投喂单细胞藻类，连续充气，每日换水一次，换水量100%，暂养水温在（12±0.5）℃。暂养期间贝类日死亡率低于5%后进行实验，实验前1 d停止投饵，选择健康、反应灵敏、个体均匀的毛蚶随机分组进行实验，实验贝类壳长2.96～3.77 cm，壳高2.39～2.82 cm，湿体质量8.62～14.27 g。

    HgCl2为贵州省铜仁化工研究所生产，含量99.5%，用双蒸水分别配制成含有Hg2+质量浓度为10 g/L母液，实验时根据不同浓度进行稀释。试验用水为人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽区海生海水晶厂出品）+双蒸水配制而来，盐度27‰，pH值8.30。

    1.2 实验方法

    1.2.1 急性毒性预实验 使用15 L水槽，加入4 L配制海水和适量药物母液，混匀后，放入10只毛蚶，保持实验水温在（12±0.5）℃，自然光照，实验期间不换水，不充气，不投饵。每个预实验浓度做一组平行试验，同时设一个对照组，取实验数据平均值。24 h、48 h和96 h后观察死亡情况，以多次刺激无反应、双壳张开、外套膜萎缩为判断其死亡的标准进行计数。通过预实验查明重金属离子不引起死亡的最大浓度（ILL）和最小100%致死浓度（LC100）。

    1.2.2 急性毒性实验 经预实验，Hg2+对毛蚶不引起死亡的ILL为0.53 mg/L，LC100为15.93 mg/L。在此Hg2+实验浓度范围内，按照等比级数设定9个浓度组，每组设3个平行，1个对照，每个水槽内随机放入10只毛蚶，实验条件与预实验条件保持一致，24 h、48 h和96 h后观察死亡情况并及时清除死亡个体。实验重复一次，最终数据取平均值。

    改进寇氏法计算LC50及95%可信限。安全浓度为LC50×AF，其中AF为应用系数，对于稳定且又易于在生物体内积累的污染物，其系数多选在0.01～0.05范围内。本实验中重金属离子属于难分解、积累性强的物质，AF值取0.01。

    1.2.3 肝脏组织切片的制备与观察 取暴露不同浓度Hg2+ 96 h的活体毛蚶，解剖，取肝脏组织，用Bouin氏液固定、经自来水冲洗、梯度酒精脱水、透明、透蜡和石蜡包埋等步骤；后进行切片，切片厚度5 μm；采用苏木精-伊红染色法（ H. E）染色，BK5000显微镜观察并拍照。

    2 结果与分析

    2.1 结果

    2.1.1 中毒症状 不同实验浓度下毛蚶的中毒反应有所不同。实验开始24 h内，低浓度组的毛蚶大部分都伸出了斧足和水管，而高浓度组中的毛蚶双壳紧闭，其中高于10.42 mg/L浓度组的部分个体黏液分泌明显，最高浓度组的个体在24 h全部死亡；24～48 h内，0.81 mg/L浓度组中的毛蚶有少数伸出斧足，0.53 mg/L浓度组的个体则几乎全部伸出斧足，高浓度组则双壳紧闭，刺激无反应，水中漂浮大量粘丝，拿起毛蚶，可见大量粘液挂在壳面上；48～96 h内，受试毛蚶的中毒现象越来越严重，出现外套膜脱落现象，高浓度组的死亡率接近100%，但0.53 mg/L浓度组的个体则仍有部分个体伸出斧足，但相比对照组中的毛蚶所伸出的斧足相对要小。总体上，Hg2+浓度越高，毛蚶所排黏液就越多。中毒死亡的个体少部分双壳张开，大部分双壳紧闭，但几乎均是外套膜、水管脱落。

    2.1.2 急性毒性实验结果 Hg2+对毛蚶的急性毒性实验具体结果见表1，Hg2+对毛蚶的半致死浓度、安全浓度及95%可信限见表2。

    2.1.3 Hg2+对毛蚶肝脏组织结构的影响 当Hg2+0.53 mg/L暴露96 h时，肝脏组织只有轻微损伤，表现为胃粘膜层的柱状细胞有增生现象但不明显，肝小管有空泡化现象；Hg2+0.81 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃粘膜层的柱状细胞有轻微增生现象，肝小管有空泡化现象；Hg2+1.24 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃粘膜层的柱状细胞有轻微增生现象，肝小管上皮细胞肿胀、细胞界限模糊，有空泡化现象；Hg2+1.90 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃粘膜层的柱状细胞有轻微增生现象，肝小管上皮细胞肿胀，同时部分肝小管有坏死现象；Hg2+2.91 mg/L暴露96 h，毛蚶的肝小管上皮细胞略微肿胀，同时部分肝小管有广泛坏死现象；Hg2+4.45 mg/L暴露96 h，毛蚶的肝小管上皮细胞界限模糊，出现了广泛坏死现象，血细胞浸润；Hg2+6.81 mg/L暴露96 h，毛蚶的胃变化并不明显，肝小管上皮细胞界限模糊，细胞明显萎缩，广泛坏死，出现了大面积空白区。

    2.2 分析

    2.2.1 重金属Hg2+对毛蚶的急性毒性效应及毒性机理 本实验在水温（12±0.5）℃、盐度27‰的环境下，研究了重金属Hg2+对毛蚶的急性毒性效应。结果表明，Hg2+对毛蚶24、48、96 h LC50分别为9.23、5.43和2.07 mg/L；安全浓度分别为0.09、0.05和 0.02 mg/L。阎波等[3]研究了Cd2+对毛蚶的急性毒性，96 h LC50为6.20 mg/L，他们所用毛蚶的个体略小于本次实验，另外报道中没有标明实验水温，但在室内实验，应该实验水温高于（12±0.5）℃；因此，这与重金属毒性的众多研究报道趋势（Hg2+>Cd2+）是一致的。王晓宇等[4]研究了Hg2+对四角蛤蜊的急性毒性，96 h LC50为0.207 mg/L，远低于本次实验值，但他们的实验水温为（15±2）℃，而本实验水温为（12±0.5）℃，而多数重金属的毒性与水温呈正相关；隋国斌等[5]研究了Hg2+对皱纹盘鲍的急性毒性，96 h LC50为0.123 mg/L，也远低于本次实验值，但其实验水温为（15±1）℃，另外，实验所用皱纹盘鲍的体质量只有本实验所用毛蚶的5%左右。

    实验开始后，低浓度组的毛蚶除最初受到人为刺激紧闭双壳外，2 h后大部分个体都伸出了斧足和水管；而高浓度组中的毛蚶则始终双壳紧闭，说明其受到Hg2+刺激后以闭壳的方式进行避毒。目前，汞对水生生物的毒害机理还未真正研究清楚，汞的毒理研究较多地集中在對水生生物（主要是鱼类和贝类）的致死浓度和体内汞积累量等方面。但汞可诱导活性氧自由基的形成并改变细胞的抗氧化能力，对水生生物构成胁迫作用，使多种酶类及活性因子失去活性，从而破坏生物体的酶系统，阻断其各种生化反应和新陈代谢活动，导致生物体死亡。

    2.2.2 Hg2+对毛蚶肝脏组织结构的影响 双壳贝类分布广、迁移性差、能高度富集水中污染物，因而是生物监测和毒理学最常被研究的群体之一。肝脏是毛蚶的主要解毒和代谢功能器官，是重金属Hg2+进入其体内的主要富集部位，当Hg2+进入体内后会诱导活性氧自由基的形成并改变细胞的抗氧化能力，一旦超过肝脏的解毒能力，就会对肝脏的组织结构产生不同程度的影响，其组织病理学评价可用于鉴定Hg2+的污染程度。

    本研究发现，Hg2+对毛蚶肝脏组织结构的影响有明显的浓度依赖性，Hg2+浓度越高，对肝脏的损伤就越明显。当暴露Hg2+0.53 mg/L时，肝脏组织只有轻微损伤，表现为胃粘膜层的柱状细胞有增生现象，但不明显；肝小管有空泡化现象；但暴露Hg2+2.91 mg/L时，肝脏组织损伤明显，表现为肝小管上皮细胞肿胀，同时部分肝小管有广泛坏死；而暴露Hg2+4.45 mg/L时，肝小管上皮细胞界限模糊，出现了广泛坏死和血细胞浸润现象；暴露Hg2+6.81 mg/L时，肝脏组织大范围坏死后已经完全失去消化腺的结构，只有部分肝小管留有轮廓，此时毛蚶的肝脏已完全失去其生理功能。高于6.81 mg/L浓度组的毛蚶在96 h前已全部死亡，因此没有取样切片。从实验结果可以看出，Hg2+2.91 mg/L浓度暴露96 h时达到了毛蚶肝脏解毒的阈值，高于此浓度会导致肝脏逐渐失去其代谢、解毒生理功能。

    参考文献：

    [1]陈静生，邓宝山，陶澎，等.环境地球化学[M].北京：海洋出版社，1990：196-235

    [2] 柳学周，徐永江，兰功刚.几种重金属离子对半滑舌鳎胚胎发育和仔稚鱼的毒性效应[J].海洋水产研究，2006，27（2）：33-42

    [3] 阎波，李英，高楠，等. Cd2+对毛蚶的毒性效应及对其SOD活性和TAOC的影响[J].天津科技大学学报，2015，30（5）：48-52

    [4] 王晓宇，王清，杨红生.镉和汞两种重金属离子对四角蛤蜊的急性毒性[J].海洋科学，2009，33（12）：24-29

    [5] 隋国斌，杨凤，孙丕海，等. 铅、镉、汞对皱纹盘鲍幼鲍的急性毒性试验[J].大连水产学院学报，1999，14（1）：22-26

    （收稿日期：2016-04-21）