复苏温度对BHK—21细胞活力的影响

    李培林++郭海平++哈申高娃++郭冠萍++赵子红

    摘要：分别用几组不同温度（37、38、39、40、41、42 ℃）的水浴来复苏BHK-21细胞，研究不同温度对BHK-21细胞的影响。结果表明，在温度为38、39 ℃时，复苏细胞的平均活力分别为99.8%、99.6%，说明了复苏温度与活力的相关性。

    关键词：BHK-21细胞；复苏；细胞活力

    中图分类号：Q813.11 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2015）06-0010-02

    动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下，高密度、大规模培养动物细胞生产生物技术产品，生产中为了使细胞的生长状态更加良好，并且能够稳定传代同时避免污染或发生细胞变异，因此，需要一种快速有效的复苏手段去复苏细胞。复苏就是以一定的复温速度将体外的培养物或生物活性物质恢复到常温下的过程，不论是微生物、动物细胞、植物细胞，还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当的温度下复苏。细胞复苏的温度一般是在37～42 ℃，不同温度的水浴对复苏BHK-21细胞活力有着一定的影响，本试验就此进行了复苏温度和活力相关性的分析研究。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞 连续传代的常规培养基培养的BHK-21细胞，按《BHK-21细胞冻存规程》冻存F68代细胞，由金宇保灵生物药品有限公司提供。

    1.1.2 培养基 45%的乳汉液（本公司自配），45%的MEM（北京清大天一生物技术有限公司），10%的犊牛血清（山西太原生物技术有限公司）。

    1.1.3 仪器设备 液氮罐（YDS-30-125F）购自山乐山市东亚机电工贸有限公司，倒置显微镜（CKX41）OLYMPUS，T75小方瓶，水浴，小离心管。超净工作台（XJ-1450）购自上海安亭科学仪器厂。

    1.2 方法

    1.2.1 常规培养基配制 将45%的乳汉液和45%的MEM混合均匀，加入10%的犊牛血清，再加入1%的碳酸氢钠，1%的双抗，0.5%的谷氨酰胺，分别倒入6个T75的方瓶中，每瓶30 mL，备用。

    1.2.2 BHK-21细胞的复苏 ①调配37～42 ℃的温水。②从液氮中取出冻存管，立刻投入37～42 ℃的温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解。③将细胞冻存液转移到离心管内，加入5 mL的培养液，轻轻吹打混匀。④将细胞液经720 r/min离心，弃去上清液。⑤向细胞沉淀内加入培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

    1.2.3 细胞计数 按《细胞培养基技术手册》（北京清大天一公司）介绍的方法进行计数：①将细胞计数板擦拭干净，盖玻片用无水乙醇预先浸泡后擦拭干净，盖于计数室上方。②取1 mL的台盼蓝放入小离心管内，取1 mL细胞液也放入此离心管内，吹打均匀，染色数分钟。③将已染好的细胞液吸出，沿盖玻片边缘自然渗入，使悬液充满盖玻片和计数板之间，不要留有气泡，也不要外溢。④静置，显微镜下观察计数板四角大方格中细胞数。细胞压中线时，一般遵循“计上不计下，计左不计右”的原则。将计数结果按以下公式计算：

    细胞活力=（细胞总数-活细胞数）/细胞总数×100%

    2 结果与分析

    从表1中可以看出，细胞在38、39 ℃下的细胞平均活力为99.8%和99.6%，明显高于其他四组水温下的细胞平均活力，说明38、39 ℃的水温是复苏细胞的最佳温度。从图1中可知，复苏水温在38、39 ℃时，曲线相对平稳，细胞的活力相对稳定，而且活力明显要高。其他几组曲线起伏波动较大，而且活力较低。因此可见，复苏细胞时，水温控制在38、39 ℃时，细胞活力较高。

    3 小结与讨论

    （1）在细胞复苏时，一般以很快的速度升温，1～2 min即可恢复到常温下，细胞内不会重新形成较大结晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长时间，从而无结晶损伤和溶质损伤，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。细胞冻存悬液一旦溶解后，要尽快去除冻存保护液，防止冻存保护液对细胞产生毒性。

    （2）在细胞复苏时，水温应该控制在38 、39 ℃下时细胞活力较高，细胞活力的高低是衡量细胞生命力的重要标志，也极大程度上影响着以后细胞的增殖，细胞的增殖是活细胞的重要生理功能，也是生物体的重要生命特征之一，是生物体生长发育，繁殖及遗传的基础。