龙葵生物碱提取及检测方法研究进展
周吉芳 黄越燕
摘要：龙葵为双子叶茄科茄属一年生草本植物，生物碱类化合物是龙葵的主要生物活性成分，具有较强的抗肿瘤活性。目前，龙葵生物碱的提取方法有溶剂提取、超声提取、微波提取、超临界萃取、柱层析等，检测方法有酸性染料比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、超高效液相色谱法等。本文对近年来龙葵生物碱提取及检测方法的研究进展进行综述，旨在为龙葵碱的研究和开发提供参考。
关键词：龙葵生物碱；提取；检测；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.040
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0133-04
Research Progress in Extraction and Detection Methods of Alkaloids from Solanum Nigrum ZHOU Ji-fang， HUANG Yue-yan （College of Medicine， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China）
Abstract： Solanum Nigrum is a kind of dicotyledon solanaceae annual herb， and alkaloids are its main bioactive constituents， with good antitumor activity. The current extraction methods for alkaloids include solvent extraction， ultrasonic extraction， microwave extraction， supercritical fluid extraction， and column chromatography etc， while the detection methods include acid dye colorimetry， thin layer scanning， high performance liquid chromatography， reversed-phase high performance liquid chromatography， and ultra-high performance liquid chromatography etc. This article reviewed the research progress in extraction and detection methods of alkaloid from Solanum Nigrum in recent years， so as to provide references for further research and development of alkaloid from Solanum Nigrum.
Key words： alkaloids from Solanum Nigrum； extraction； detection； review
龙葵Solanum nigrum L.系双子叶茄科茄属一年生草本植物，全国各地均有分布。其性寒，味苦、微甘，有小毒，有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、止咳祛痰功效。龙葵全草含生物碱、多糖、皂苷等多种成分，其中龙葵生物碱类成分包括龙葵碱（Solanine）、龙葵定碱（Solanigridine）、澳洲茄碱（Solasonine）、澳洲茄边碱（Solamargine）、澳洲茄明碱（Solasodamine）和糖苷生物碱（glycoalkaloids）等[1]，其抗肿瘤作用及其机制研究是近年的研究热点[2]。兹综述近年来国内外对龙葵生物碱提取分离和检测方面新技术的研究现状，分析其原理及优缺点，以期为龙葵生物碱研究和开发提供参考。
1 提取方法
1.1 传统提取方法
1.1.1 水或酸水回流提取法 碱性较强的生物碱在植物体中多成盐，可溶于水；而碱性较弱或中性生物
基金项目：浙江省教育厅科研项目（Y201431468）；嘉兴市科技局科技项目（2009AY2067）；嘉兴学院校级SRT项目（2014年）；浙江省教育科学规划课题（2015SCG060）
碱则以不稳定的盐或游离碱的形式存在。因此，可采用0.5%～1%的乙酸、硫酸、盐酸等作为提取溶剂，提取液经浓缩后，再以碱化使生物碱游离出来，用有机溶剂萃取。周氏[3]采用乙醇回流、水回流及乙醇渗漉法分别提取龙葵总生物碱，结果水提取的总碱得率为1.05%，低于乙醇回流和乙醇渗漉。张氏等[4]采用80%乙醇、1%盐酸、3%醋酸分别从龙葵中提取澳洲茄边碱，提取率分别为0.51、0.39、0.28 mg/g。黄氏等[5]采用酸水回流提取龙葵生物碱用于体外抑瘤细胞生长实验，在龙葵粉末中加入15倍量的2 mol/L HCl与90%乙醇1∶4（V∶V）的混合溶剂，密闭浸泡后加热回流提取2次，每次3 h，提取液回收乙醇后浓缩至浸膏，加酸溶解后用氯仿萃取，水层调节pH值至碱性，弃去上清，收集沉淀，干燥后得到龙葵碱。以水或酸水为提取溶剂，操作简便，成本低，但提取次数多，提取液体积大、杂质多，浓缩和后续处理较困难。
1.1.2 醇回流提取法 游离生物碱及其盐类一般能溶于甲醇和乙醇，因甲醇毒性较大，故常用乙醇作为生物碱的提取溶剂。刘氏等[6]采用乙醇提取龙葵生物碱，分别考察了乙醇浓度、提取温度、提取时间三因素，确定的最佳工艺条件为乙醇浓度90%、提取时间5 h、提取温度40 ℃，提取率可达1.8%～2.7%。张氏等[4]在研究澳洲茄边碱的提取工艺时发现，提取溶剂用量对提取率影响最大，回流次数影响最小，经正交试验得到最佳提取工艺为料液比1∶20时用80%乙醇回流提取2次、每次4 h，澳洲茄边碱的平均提取率为0.621 mg/g。该研究认为，酸水中加热易导致澳洲茄边碱水解，故不宜采用酸水热浸或回流提取。唐氏等[7]用80%乙醇回流对龙葵药材提取后，经纯化用于抗肿瘤活性研究，其提取工艺为粗粉用12倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇后调节pH=9，离心得到沉淀，经干燥后用甲醇溶解拌样，硅胶柱分离，依次用氯仿-甲醇极性递增梯度洗脱，当氯仿-甲醇8∶1时洗脱得粗澳洲茄边碱，经甲醇重结晶得澳洲茄边碱。王氏等[8]采用Box-Behnken效应面法考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数等因素对龙葵总生物碱醇提工艺的影响，结果确定最佳工艺条件：乙醇体积分数63.72%，料液比1∶41.23，提取时间54.93 min，提取2次，龙葵总生物碱提取率为1.40 mg/g。
1.2 现代提取分离方法
随着科技发展，一些新技术开始用于生物碱的提取，如超临界流体萃取、生物酶法、膜分离技术、分子印迹技术等，能够提高提取效率，降低过程能耗，保持生物碱的品质和活性。其中超声提取、微波提取、超临界流体提取等方法已在龙葵生物碱类化合物的提取过程中得到应用。
1.2.1 超声提取法 超声波提取（UE）是利用超声波产生的高频机械振动波在溶液体系中产生的空化作用，使植物细胞壁破坏和溶剂快速渗透，从而使细胞中的成分溶解于溶剂，实现固液萃取分离。UE具有时间短、效率高、节约能源等优点，可用于热敏性成分的提取。
栾氏等[9]采用超声辅助提取龙葵生物总碱，在传统醇提的最佳工艺基础上，分别考察了提取时间和超声频率对提取效果的影响，结果采用频率59 kHz超声辅助提取30 min得到的生物碱收率略高于传统乙醇提取。该方法所用时间短，不需另外加热，是节能可行的提取方式。 1.2.2 微波提取法 微波提取（MAE）是利用微波与介质的离子和偶极子分子的相互作用，促使介质转动能力跃迁，加剧热运动，使细胞壁破裂，胞外溶剂易于进入细胞内，溶解并释放胞内产物。MAE具有加热均匀、热效率高、节能省时的优点。刘氏等[10]研究了龙葵生物碱的MAE技术，以酸性染料比色法为分析手段，选取提取时间、提取功率及料液比等因素设计正交试验，得到最佳提取工艺是以95%乙醇为溶剂、料液比1∶20、在585 W功率下提取8 min，并认为微波作用对龙葵总生物碱结构基本无破坏影响。么氏等[11]比较了回流、微波和超临界二氧化碳（CO2）萃取3种方法对龙葵总生物碱的提取作用，认为最佳提取方法为MAE。但MAE受提取溶剂、提取时间、提取温度等因素影响，选择不同参数调节，会得到不同提取效果。
1.2.3 超临界流体萃取法 超临界流体是处于临界温度和临界压力以上的流体，兼有气体和液体的双重特性，既具有与气体相当的高扩散系数和低黏度，又具有与液体相近的密度，对物质具有良好的溶解力，可作溶剂进行萃取分离。CO2因无色无毒、无腐蚀、化学惰性、安全价廉、高纯度等优点，是首选的清洁型工业萃取剂。么氏等[11]采用超临界CO2流体萃取探索龙葵果总生物碱的提取工艺，以萃取温度、压力和时间为影响因素进行正交试验和分析，确定最佳条件为萃取温度50 ℃、萃取压30 MPa、萃取时间100 min。超临界流体萃取法具有萃取和分离的双重作用，提取效率高，节能明显，无有机溶剂残留，无环境污染，但仅适于分子量较小、低极性化合物的萃取，且因其生产成本和设备投资高，故多用于实验室研究，尚未用于工业生产。
1.2.4 柱层析法 该法是将固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动可达到分离提取的目的。李氏等[12]采用柱层析方法分离龙葵中的化学成分，龙葵药粉以10倍量80%乙醇提取2次后，减压回收乙醇，经HPD100大孔树脂分离纯化，分别用水、15%乙醇除杂，收集70%乙醇洗脱部分，回收乙醇，调pH=9，静置离心，所得沉淀上葡聚糖凝胶LH-20纯化，可得澳洲茄碱、澳洲茄边碱纯品。
2 检测方法
2.1 酸性染料比色法
生物碱盐与酸性染料溴甲酚绿在醋酸-醋酸钠缓冲液中形成有色离子对化合物，可被有机溶剂定量萃取，用比色法测定该有机相溶液的吸光度，对照标准曲线可确定生物碱含量。王氏等[8]在研究龙葵总生物碱提取工艺时采用酸性染料比色法，以紫外分光光度计测定总生物碱的含量。
2.2 薄层扫描法
薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有紫外光和可见光吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，扫描得到的图谱及积分数据可用于药品的鉴别、检查和含量测定，具有分离效能高、快速、简便等优点。梁氏等[13]用薄层扫描法测定龙葵中茄碱的苷元澳洲茄胺的含量，样品及对照品以苯-甲醇（10∶2）为展开剂，0.5 g/L多聚甲醛的磷酸溶液为显色剂，于薄层扫描仪上进行测定：λS=510 nm，λR=700 nm。结果显示，澳洲茄胺在1.965～11.79 μg呈一不通过原点的直线，采用外标两点法定量，测得龙葵果实及全草中澳洲茄胺含量分别为1.16%、0.092 8%。
2.3 高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）采用了梯度洗脱装置，应用范围广、分离效能高、灵敏度高、分析速度快，可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差、性质和结构类似生物碱的分离及分析，因此在龙葵生物碱类的含量检测中应用较多[14-16]。袁氏等[17]采用HPLC测定龙葵中澳洲茄碱，采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm），以乙腈-1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长205 nm，柱温30 ℃。结果显示，澳洲茄碱在0.812～8.120 μg范围内呈良好线性关系，r=0.999 8，平均加样回收率为100.22%。罗氏等[18]采用HPLC对龙葵中澳洲茄胺的含量测定进行探索，以甲醇-酸水超声提取龙葵生物碱，在回流条件下对生物碱苷进行酸性水解，得到澳洲茄胺，进行HPLC检测，色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）体系为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm。结果澳洲茄胺线性范围在102～612 μg/mL（r=0.999 9），加样回收率96.0%，RSD为3.35%。李氏等[19]通过HPLC测定澳洲茄胺盐酸盐含量，色谱柱为ZorbaxExtend-C18（250 mm×4.5 mm），乙腈-甲醇-乙酸铵为流动相（60∶35∶5），检测波长204 nm，测定得澳洲茄胺盐酸盐在0.8～160 mg/L时线性关系良好，平均回收率为98.6%。李氏等[12]测定龙葵药材澳洲茄碱、澳洲茄边碱含量，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm），流动相为乙腈-2 mmol/L Na2HPO4水溶液（39∶61），检测波长203 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，结果澳洲茄碱在0.395～6.32 μg（r=0.999 6）线性关系良好，澳洲茄边碱在0.40～6.40 μg（r=0.999 9）线性关系良好。
2.4 反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的典型固定相是十八烷基键合硅胶，典型流动相是甲醇和乙腈。袁氏等[20]采用RP-HPLC同时分析龙葵中3种甾体生物碱，采用Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱，以乙腈-1%磷酸为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，于205 nm波长检测，梯度洗脱分离澳洲茄碱、澳洲茄边碱和khasianine 3种生物碱。结果澳洲茄碱含量测定的线性范围为0.860～10.320 μg（r=0.999 7），澳洲茄边碱含量测定的线性范围为0.726～8.710 μg（r=0.999 7），khasianine含量测定的线性范围为0.696～8.352 μg（r=0.999 8），平均回收率分别为100.18%、99.08%、99.88%。表明该方法简便快速、准确度高。
2.5 超高效液相色谱法
李氏等[21]建立澳洲茄碱、澳洲茄边碱和khasianine超高效液相色谱同时检测方法，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×250 mm，1.7 μm），甲醇-0.5%乙酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为205 nm，流速0.5 mL/min，柱温35 ℃，结果3个成分依次在0.865～17.300 μg、0.730～14.600 μg、0.700～14.000 μg内线性关系良好（r=0.999 9），平均加样回收率分别为98.86%、98.91%、98.27%，均RSD<1.50%。
3 展望
龙葵生物碱类化合物是龙葵具有生理活性的重要成分，在传统提取方法的基础上合理使用新技术辅助提取或合用，可有效改善提取及纯化效果。但超临界萃取等方法还存在分离产量低、成本高等问题，如何将一些提取新技术用到生产中去，还有许多问题有待解决。随着含量分析测定技术的发展，多组分同时检测逐渐成为龙葵生物碱类化合物分析领域的发展趋势，HPLC因其高分辨率、高灵敏度、高效性、重现性好、适用性强等优点，用于龙葵生物碱的分离和鉴定具有较好的优势。
参考文献：
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[21] 李志辉，孟军华，肖晖.龙葵的质量分析研究[J].中药新药与临床药理，2012，23（6）：661-664.
（收稿日期：2015-03-21）
（修回日期：2015-06-27；编辑：梅智胜）
摘要：龙葵为双子叶茄科茄属一年生草本植物，生物碱类化合物是龙葵的主要生物活性成分，具有较强的抗肿瘤活性。目前，龙葵生物碱的提取方法有溶剂提取、超声提取、微波提取、超临界萃取、柱层析等，检测方法有酸性染料比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、超高效液相色谱法等。本文对近年来龙葵生物碱提取及检测方法的研究进展进行综述，旨在为龙葵碱的研究和开发提供参考。
关键词：龙葵生物碱；提取；检测；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.040
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0133-04
Research Progress in Extraction and Detection Methods of Alkaloids from Solanum Nigrum ZHOU Ji-fang， HUANG Yue-yan （College of Medicine， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China）
Abstract： Solanum Nigrum is a kind of dicotyledon solanaceae annual herb， and alkaloids are its main bioactive constituents， with good antitumor activity. The current extraction methods for alkaloids include solvent extraction， ultrasonic extraction， microwave extraction， supercritical fluid extraction， and column chromatography etc， while the detection methods include acid dye colorimetry， thin layer scanning， high performance liquid chromatography， reversed-phase high performance liquid chromatography， and ultra-high performance liquid chromatography etc. This article reviewed the research progress in extraction and detection methods of alkaloid from Solanum Nigrum in recent years， so as to provide references for further research and development of alkaloid from Solanum Nigrum.
Key words： alkaloids from Solanum Nigrum； extraction； detection； review
龙葵Solanum nigrum L.系双子叶茄科茄属一年生草本植物，全国各地均有分布。其性寒，味苦、微甘，有小毒，有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、止咳祛痰功效。龙葵全草含生物碱、多糖、皂苷等多种成分，其中龙葵生物碱类成分包括龙葵碱（Solanine）、龙葵定碱（Solanigridine）、澳洲茄碱（Solasonine）、澳洲茄边碱（Solamargine）、澳洲茄明碱（Solasodamine）和糖苷生物碱（glycoalkaloids）等[1]，其抗肿瘤作用及其机制研究是近年的研究热点[2]。兹综述近年来国内外对龙葵生物碱提取分离和检测方面新技术的研究现状，分析其原理及优缺点，以期为龙葵生物碱研究和开发提供参考。
1 提取方法
1.1 传统提取方法
1.1.1 水或酸水回流提取法 碱性较强的生物碱在植物体中多成盐，可溶于水；而碱性较弱或中性生物
基金项目：浙江省教育厅科研项目（Y201431468）；嘉兴市科技局科技项目（2009AY2067）；嘉兴学院校级SRT项目（2014年）；浙江省教育科学规划课题（2015SCG060）
碱则以不稳定的盐或游离碱的形式存在。因此，可采用0.5%～1%的乙酸、硫酸、盐酸等作为提取溶剂，提取液经浓缩后，再以碱化使生物碱游离出来，用有机溶剂萃取。周氏[3]采用乙醇回流、水回流及乙醇渗漉法分别提取龙葵总生物碱，结果水提取的总碱得率为1.05%，低于乙醇回流和乙醇渗漉。张氏等[4]采用80%乙醇、1%盐酸、3%醋酸分别从龙葵中提取澳洲茄边碱，提取率分别为0.51、0.39、0.28 mg/g。黄氏等[5]采用酸水回流提取龙葵生物碱用于体外抑瘤细胞生长实验，在龙葵粉末中加入15倍量的2 mol/L HCl与90%乙醇1∶4（V∶V）的混合溶剂，密闭浸泡后加热回流提取2次，每次3 h，提取液回收乙醇后浓缩至浸膏，加酸溶解后用氯仿萃取，水层调节pH值至碱性，弃去上清，收集沉淀，干燥后得到龙葵碱。以水或酸水为提取溶剂，操作简便，成本低，但提取次数多，提取液体积大、杂质多，浓缩和后续处理较困难。
1.1.2 醇回流提取法 游离生物碱及其盐类一般能溶于甲醇和乙醇，因甲醇毒性较大，故常用乙醇作为生物碱的提取溶剂。刘氏等[6]采用乙醇提取龙葵生物碱，分别考察了乙醇浓度、提取温度、提取时间三因素，确定的最佳工艺条件为乙醇浓度90%、提取时间5 h、提取温度40 ℃，提取率可达1.8%～2.7%。张氏等[4]在研究澳洲茄边碱的提取工艺时发现，提取溶剂用量对提取率影响最大，回流次数影响最小，经正交试验得到最佳提取工艺为料液比1∶20时用80%乙醇回流提取2次、每次4 h，澳洲茄边碱的平均提取率为0.621 mg/g。该研究认为，酸水中加热易导致澳洲茄边碱水解，故不宜采用酸水热浸或回流提取。唐氏等[7]用80%乙醇回流对龙葵药材提取后，经纯化用于抗肿瘤活性研究，其提取工艺为粗粉用12倍量80%乙醇回流提取2次，每次2 h，回收乙醇后调节pH=9，离心得到沉淀，经干燥后用甲醇溶解拌样，硅胶柱分离，依次用氯仿-甲醇极性递增梯度洗脱，当氯仿-甲醇8∶1时洗脱得粗澳洲茄边碱，经甲醇重结晶得澳洲茄边碱。王氏等[8]采用Box-Behnken效应面法考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数等因素对龙葵总生物碱醇提工艺的影响，结果确定最佳工艺条件：乙醇体积分数63.72%，料液比1∶41.23，提取时间54.93 min，提取2次，龙葵总生物碱提取率为1.40 mg/g。
1.2 现代提取分离方法
随着科技发展，一些新技术开始用于生物碱的提取，如超临界流体萃取、生物酶法、膜分离技术、分子印迹技术等，能够提高提取效率，降低过程能耗，保持生物碱的品质和活性。其中超声提取、微波提取、超临界流体提取等方法已在龙葵生物碱类化合物的提取过程中得到应用。
1.2.1 超声提取法 超声波提取（UE）是利用超声波产生的高频机械振动波在溶液体系中产生的空化作用，使植物细胞壁破坏和溶剂快速渗透，从而使细胞中的成分溶解于溶剂，实现固液萃取分离。UE具有时间短、效率高、节约能源等优点，可用于热敏性成分的提取。
栾氏等[9]采用超声辅助提取龙葵生物总碱，在传统醇提的最佳工艺基础上，分别考察了提取时间和超声频率对提取效果的影响，结果采用频率59 kHz超声辅助提取30 min得到的生物碱收率略高于传统乙醇提取。该方法所用时间短，不需另外加热，是节能可行的提取方式。 1.2.2 微波提取法 微波提取（MAE）是利用微波与介质的离子和偶极子分子的相互作用，促使介质转动能力跃迁，加剧热运动，使细胞壁破裂，胞外溶剂易于进入细胞内，溶解并释放胞内产物。MAE具有加热均匀、热效率高、节能省时的优点。刘氏等[10]研究了龙葵生物碱的MAE技术，以酸性染料比色法为分析手段，选取提取时间、提取功率及料液比等因素设计正交试验，得到最佳提取工艺是以95%乙醇为溶剂、料液比1∶20、在585 W功率下提取8 min，并认为微波作用对龙葵总生物碱结构基本无破坏影响。么氏等[11]比较了回流、微波和超临界二氧化碳（CO2）萃取3种方法对龙葵总生物碱的提取作用，认为最佳提取方法为MAE。但MAE受提取溶剂、提取时间、提取温度等因素影响，选择不同参数调节，会得到不同提取效果。
1.2.3 超临界流体萃取法 超临界流体是处于临界温度和临界压力以上的流体，兼有气体和液体的双重特性，既具有与气体相当的高扩散系数和低黏度，又具有与液体相近的密度，对物质具有良好的溶解力，可作溶剂进行萃取分离。CO2因无色无毒、无腐蚀、化学惰性、安全价廉、高纯度等优点，是首选的清洁型工业萃取剂。么氏等[11]采用超临界CO2流体萃取探索龙葵果总生物碱的提取工艺，以萃取温度、压力和时间为影响因素进行正交试验和分析，确定最佳条件为萃取温度50 ℃、萃取压30 MPa、萃取时间100 min。超临界流体萃取法具有萃取和分离的双重作用，提取效率高，节能明显，无有机溶剂残留，无环境污染，但仅适于分子量较小、低极性化合物的萃取，且因其生产成本和设备投资高，故多用于实验室研究，尚未用于工业生产。
1.2.4 柱层析法 该法是将固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动可达到分离提取的目的。李氏等[12]采用柱层析方法分离龙葵中的化学成分，龙葵药粉以10倍量80%乙醇提取2次后，减压回收乙醇，经HPD100大孔树脂分离纯化，分别用水、15%乙醇除杂，收集70%乙醇洗脱部分，回收乙醇，调pH=9，静置离心，所得沉淀上葡聚糖凝胶LH-20纯化，可得澳洲茄碱、澳洲茄边碱纯品。
2 检测方法
2.1 酸性染料比色法
生物碱盐与酸性染料溴甲酚绿在醋酸-醋酸钠缓冲液中形成有色离子对化合物，可被有机溶剂定量萃取，用比色法测定该有机相溶液的吸光度，对照标准曲线可确定生物碱含量。王氏等[8]在研究龙葵总生物碱提取工艺时采用酸性染料比色法，以紫外分光光度计测定总生物碱的含量。
2.2 薄层扫描法
薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有紫外光和可见光吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，扫描得到的图谱及积分数据可用于药品的鉴别、检查和含量测定，具有分离效能高、快速、简便等优点。梁氏等[13]用薄层扫描法测定龙葵中茄碱的苷元澳洲茄胺的含量，样品及对照品以苯-甲醇（10∶2）为展开剂，0.5 g/L多聚甲醛的磷酸溶液为显色剂，于薄层扫描仪上进行测定：λS=510 nm，λR=700 nm。结果显示，澳洲茄胺在1.965～11.79 μg呈一不通过原点的直线，采用外标两点法定量，测得龙葵果实及全草中澳洲茄胺含量分别为1.16%、0.092 8%。
2.3 高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）采用了梯度洗脱装置，应用范围广、分离效能高、灵敏度高、分析速度快，可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差、性质和结构类似生物碱的分离及分析，因此在龙葵生物碱类的含量检测中应用较多[14-16]。袁氏等[17]采用HPLC测定龙葵中澳洲茄碱，采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm），以乙腈-1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长205 nm，柱温30 ℃。结果显示，澳洲茄碱在0.812～8.120 μg范围内呈良好线性关系，r=0.999 8，平均加样回收率为100.22%。罗氏等[18]采用HPLC对龙葵中澳洲茄胺的含量测定进行探索，以甲醇-酸水超声提取龙葵生物碱，在回流条件下对生物碱苷进行酸性水解，得到澳洲茄胺，进行HPLC检测，色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）体系为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm。结果澳洲茄胺线性范围在102～612 μg/mL（r=0.999 9），加样回收率96.0%，RSD为3.35%。李氏等[19]通过HPLC测定澳洲茄胺盐酸盐含量，色谱柱为ZorbaxExtend-C18（250 mm×4.5 mm），乙腈-甲醇-乙酸铵为流动相（60∶35∶5），检测波长204 nm，测定得澳洲茄胺盐酸盐在0.8～160 mg/L时线性关系良好，平均回收率为98.6%。李氏等[12]测定龙葵药材澳洲茄碱、澳洲茄边碱含量，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm），流动相为乙腈-2 mmol/L Na2HPO4水溶液（39∶61），检测波长203 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，结果澳洲茄碱在0.395～6.32 μg（r=0.999 6）线性关系良好，澳洲茄边碱在0.40～6.40 μg（r=0.999 9）线性关系良好。
2.4 反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的典型固定相是十八烷基键合硅胶，典型流动相是甲醇和乙腈。袁氏等[20]采用RP-HPLC同时分析龙葵中3种甾体生物碱，采用Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱，以乙腈-1%磷酸为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，于205 nm波长检测，梯度洗脱分离澳洲茄碱、澳洲茄边碱和khasianine 3种生物碱。结果澳洲茄碱含量测定的线性范围为0.860～10.320 μg（r=0.999 7），澳洲茄边碱含量测定的线性范围为0.726～8.710 μg（r=0.999 7），khasianine含量测定的线性范围为0.696～8.352 μg（r=0.999 8），平均回收率分别为100.18%、99.08%、99.88%。表明该方法简便快速、准确度高。
2.5 超高效液相色谱法
李氏等[21]建立澳洲茄碱、澳洲茄边碱和khasianine超高效液相色谱同时检测方法，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×250 mm，1.7 μm），甲醇-0.5%乙酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为205 nm，流速0.5 mL/min，柱温35 ℃，结果3个成分依次在0.865～17.300 μg、0.730～14.600 μg、0.700～14.000 μg内线性关系良好（r=0.999 9），平均加样回收率分别为98.86%、98.91%、98.27%，均RSD<1.50%。
3 展望
龙葵生物碱类化合物是龙葵具有生理活性的重要成分，在传统提取方法的基础上合理使用新技术辅助提取或合用，可有效改善提取及纯化效果。但超临界萃取等方法还存在分离产量低、成本高等问题，如何将一些提取新技术用到生产中去，还有许多问题有待解决。随着含量分析测定技术的发展，多组分同时检测逐渐成为龙葵生物碱类化合物分析领域的发展趋势，HPLC因其高分辨率、高灵敏度、高效性、重现性好、适用性强等优点，用于龙葵生物碱的分离和鉴定具有较好的优势。
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（收稿日期：2015-03-21）
（修回日期：2015-06-27；编辑：梅智胜）
