广西猪圆环病毒2型全基因扩增及来源分析

     薛新绵

    

    

    摘要:某猪场发生疫情,通过聚合酶链反应(PCR)检测、扩增猪圆环病毒2型(PCV2)GX-20全基因序列,通过与国内外毒株同源性比对、绘制系统发育进化树,发现GX-20与广东、湖南、贵州和山东等周边省份同源性较高,且高于历年分离的广西流行毒株,结合引种情况,推测GX-20是由于引种从广东传播到广西。

    关键词:猪圆环病毒2型;全基因扩增;来源

    中图分类号:$852.65+1 文献标识码:B文章编号:2095-9737(2020)06-0008-02

    猪圆环病毒2型(poreine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(PCV2-associateddiseases,PCVAD)的主要病原,该病是严重危害全球养猪业的猪场重要传染病,每年给我国造成巨大经济损失。PCV2是无囊膜的单股环状负链DNA病毒,全长约1800bp,包含5个开放阅读框,编碼Rep、Rep、Cap等蛋白。根据病毒全基因组和Cap基因,可将PCV2分为8个基因型,其中PCV2a、PCV2b、PCV2d在全球广泛流行。2010年我国检出的PCV2变异毒株属于PCVgd亚型。

    作者在发病猪群中检出PCV2,通过扩增其全基因、与国内外毒株进行同源性比对,结合生产实际,推测该病毒来源,为掌握近年来广西PCV2流行和变异、掌握病毒遗传进化以及致病机理的研究提供数据参考。

    1材料和方法

    1.1材料

    pMD18-T载体、大肠杆菌DH5a、LA TaqMix、LB培养基、DNA抽提试剂盒等试剂分别购自Takara公司、生工生物工程(上海)股份有限公司。

    1.2样品采集、抽提及PCV2全基因扩增

    发病猪组织样品来源于本地某猪场,采集猪肺脏、淋巴结、脾脏和肝脏。将组织样品与无菌PBS按照1:4混合、研磨制成匀浆,冻融3次后,离心取上清,用于抽提基因组DNA。以基因组DNA为模板,进行PCV2全基因扩增。引物及反应条件(表1)、反应体系参考文献。

    1.3DNA片段纯化、克隆和测序

    PCR产物经1%琼脂糖电泳后,参考胶回收试剂盒说明书,回收、纯化目的片段,4℃连接pMD-18T过夜,按照文献介绍的方法,转化DH5a感受态细胞,涂布LB平板,培养过夜后,挑取单个菌落,接种于LB培养基,按照质粒DNA小量提取试剂盒说明书抽提质粒,鉴定后,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

    1.4同源性分析及病毒来源

    运用DNAStar对获得的PCV2全基因序列进行同源性分析,结合国外及国内各省获得的PCV2毒株序列,构建系统进化树,用于分析病毒来源。

    2结果与分析

    2.1PCV2全基因扩增

    利用特异性引物扩增出约1767bp基因片段(图1),与预期目的基因大小相符。将该毒株命名为GX-20。

    2.2PCV2全基因序列测定与分析

    GX-20的PCV2全基因扩增片段经克隆、测序后,获得全长1767bp序列。利用DNAStar分析其与3株国外PCVl毒株和19株国内PCV2毒株的同源性。发现GX-20与19株国内毒株全基因核苷酸序列同源性为95.2%~98.8%,最低的是GXGG毒株,最高的是GD毒株;与7株广西周边省份PCV2毒株(GY06、GD-zl、GD、GD-TS、HN07、HN10、AH05)全基因核苷酸序列之间的同源性为96.8%~98.8%,最低的是AH05毒株,最高GD毒株;与10株广西PCV2毒株(GXGW、GXHK、GXHP、GX、GXWZ、GXLC、GXHZ-1、GXHZ-2、GXGG、GXZZ)之间的同源性为95.2%~98.7%,同源性最低为GXGG毒株,最高为GXHP毒株;与3株国外PCVl毒株之间全基因核苷酸序列的同源性为76.4%~77.O%。

    根据同源性比对,绘制PCV2系统进化树(图2),可见:PCV分成PCV1、PCV2两大分支,3株PCVl毒株形成PCV1分支,其他20株PCV2毒株形成PCV2分支。而PCV2分支又分为两支,其中GXGG单独位于一个分支,其他19株位于另一个分支。本研究的GX-20与3株广东株(GD、GD-TS、GD-ZJ)、4株广西株(GXWZ、GXZZ、GXHP、GXGW)、1株湖南株、1株山东株、1株贵阳株亲缘关系较近,其中与GD株亲缘关系最近,与广西株(GXHZ-1、GXHZ-2、GXGG)亲缘关系较远。结合发病猪群是近日从广东引种来到广西,因此,推测GX-20随着引种由广东传播到广西。

    3小结

    广西是我国畜牧养殖业大省,PCV2是阻碍广西养猪业发展的重要疫病,每年造成巨大经济损失;而且PCV2感染可致机体免疫抑制,降低机体免疫水平,导致其他病原的继发感染,给疫病防控带来巨大挑战,因此是养猪业重点监测对象。

    近日,从发病猪群中检出PCV2病毒,通过全基因扩增、克隆、测序、分析等发现,该毒株与广东、湖南、贵州、山东等省分离株同缘关系较近,与广西分离株同源关系较远,结合引种,推测该毒株是由广东传播到广西。因此,应加强今后引种过程中疫病防控。

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