浙产女贞子中红景天苷含量动态变化及区域差异性研究
程斌 周爱珍 凌庆枝
摘要：目的 采用高效液相色谱法测定不同生长期、不同区域浙产女贞子中的红景天苷含量，为更合理、有效地从女贞子中提取红景天苷提供依据。方法 色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流动相：乙腈-水（10∶90）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。结果 红景天苷在0.71～3.55 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r=0.999 4）；加样回收率在95.6%～98.6%之间，平均加样回收率为96.88%，RSD=1.32%（n=5）。结论 红景天苷在女贞子中的含量随生长期延长逐渐下降，不同区域、不同采收期女贞子中红景天苷的含量不同。
关键词：女贞子；红景天苷；含量变化；区域差异；浙江
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0095-03
Study on Dynamic Changes and Regional Differences of Content of Salidroside in Ligustri Lucidi Fructus in Zhejiang Province CHENG Bin1，2， ZHOU Ai-zheng1， LING Qing-zhi1 （1. Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo 325035， China； 2. Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）
Abstract： Objective To determine content of Salidroside in Ligustri Lucidi Fructus at different growth stages and in different regions in Zhejiang Province by HPLC； To provide the basis for more rational， efficient extraction of Salidroside from Ligustri Lucidi Fructus. Methods The Kromasil C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was used with mobile phase of acetonitrile-water （10：90）； flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 220 nm； column temperature was set at room temperature； injection volume was 20 μL. Results Salidroside was in good linear range within 0.71–3.55 μg （r=0.999 4）. The recovery rate of Salidroside was 95.6%–98.6% and the average recovery rate was 96.88%， RSD was 1.32% （n=5）. Conclusion The content of Salidroside in Ligustri Lucidi Fructus gradually decreased with the extending of growing season. The contents of Salidroside were different at different growth stages and in different regions.
Key words： Ligustri Lucidi Fructus； Salidroside； content changes； regional differences； Zhejiang Province
红景天苷是景天科红景天属植物的主要有效成分之一，具有抗缺氧、保护心脑血管、抗肝纤维化等多种药理作用，作为药品、保健食品的原料得到广泛开发应用，但天然红景天植物资源逐渐匮乏，导致红景天苷价格昂贵，已成为其进一步开发利用的瓶颈。女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum Lucidum Ait.的干燥成熟果实，主产于浙江、江苏、安徽等地，为临床常用补虚药，味甘、苦，性凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发功效，常用于治疗肝肾阴虚引起的目暗不明、视力减退、须发早白。女贞子化学成分包括三萜类、黄酮类、裂环环烯醚萜类和对羟基苯乙醇
基金项目：浙江省教育厅一般科研项目（Y201226174）；高等学校访问工程师校企合作项目（FW2012004）；浙江医药高等专科学校校级科研课题（ZPCSR2010002）
苷类等化合物[1-2]，其中红景天苷含量可观，有望成为红景天苷的另一有效的天然来源[3-4]。且女贞子在浙江地区药材资源丰富，随着天然红景天植物资源逐渐匮乏，从女贞子中提取红景天苷具有较大的开发前景。
目前，2010年版《中华人民共和国药典》（一部）以特女贞苷为指标成分[5-6]，香港中药材标准以红景天苷为指标成分对女贞子进行质量控制[7]，表明红景天苷及裂环环烯醚萜苷类的含量代表了女贞子药材的内在质量。女贞子中红景天苷测定的方法已有报道[8-12]，本研究考察浙产女贞子不同成果期（9-12月）红景天苷含量的动态变化及浙江不同地区女贞子红景天苷含量的差异，从而确定女贞子的最佳采收时间及采收区域，为更合理、有效地从女贞子中提取红景天苷提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），HP色谱工作站（美国Agilent公司），Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），UV-2300扫描型紫外可见分光光度计（上海美谱达），JA2003N型电子天平（感量0.001 g，上海科技仪器公司），KQ-250E型医用超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。
红景天苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号110818-200404）；乙腈（山东禹王，色谱纯），水为自制高纯水，其余试剂均为分析纯。
分别在宁波、温州、衢州、湖州4个地区，于女贞子3个不同成果期（10、11、12月）采集女贞子药材，采样植物经浙江医药高等专科学校杨雄志教授鉴定为木犀科植物女贞Ligustrum Lucidum Ait.的干燥成熟果实。详见表1。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取红景天苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含红景天苷0.568 mg的对照品储备溶液；精密吸取浓度为0.568 mg/mL的红景天苷对照品储备液2.5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得红景天苷浓度为0.142 mg/mL的对照品溶液，低温避光贮藏，备用。
2.2 供试品溶液的制备
取女贞子干燥粉末，过3号筛，称取1.0 g样品，精密称定，置25 mL容量瓶中，加60%甲醇定容，密塞，摇匀，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，补足挥发的甲醇至刻度，密塞，摇匀，过膜，取续滤液，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙睛-水（10∶90）等度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：室温。分别吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL，按上述色谱条件进样，色谱图见图1。
2.4 线性关系考察
取“2.1”项下对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25 ?L，在上述色谱条件下测定，以红景天苷进样量（μg）分别对相应峰面积积分值进行线性回归，得回归方程Y=2964.7X+1003.4（r=0.999 4），表明红景天苷在0.71～3.55 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取红景天苷浓度为0.142 mg/mL的对照品溶液20 μL，在上述色谱条件下连续重复进样6次；取上述对照品溶液在第1、2、3、4、5日分别进样测定，结果日内精密度峰面积的RSD=0.32%，日间精密度峰面积的RSD=0.47 %，表明红景天苷对照品溶液的日内精密度和日间精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一产地、同一生长期的女贞子样品（2号），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进样20 μL，测定，结果供试品溶液中红景天苷峰面积的RSD分别为0.29%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.7 重复性试验
取同一产地、同一生长期的女贞子样品（2号）5份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 ?L，测定。结果样品中红景天苷平均含量为3.084 mg/g，RSD=1.9%，表明重复性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的女贞子样品（2号）5份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.568 mg/mL的红景天苷对照品储备溶液2.6 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 ?L，测定，计算加样回收率，结果红景天苷加样回收率在95.6%～98.6%之间，平均回收率为96.88 %，RSD=1.32%，符合要求，见表2。
3 讨论
全紫外波长扫描表明，红景天苷在220 nm波长处有较高吸收，峰面积的积分值较高，故此含量测定的检测波长为220 nm。分别以甲醇-水（20∶80）和乙腈-水（20∶80）作为流动相等度洗脱，考察不同流动相条件下样品中红景天苷的分离效果。结果表明，乙腈-水（20∶80）系统中，各峰均有较好的峰型，红景天苷响应良好，但分离度欠佳。故在此基础上调整两者的比例为乙腈-水（10∶90），结果显示，红景天苷有较好的分离度和响应值。
红景天苷极性大，易溶于甲醇、乙醇，因提取溶剂、浓度、方法对女贞子中红景天苷的溶出有很大影响，故本试验分别考察了不同提取溶剂（水、甲醇、乙醇）、提取方法（超声、回流）和浓度（60%、80%、100%）条件下女贞子中红景天苷的分离效果。结果表面，用60%甲醇超声提取，样品中红景天苷的峰型较好，峰面积较高，提取简便。
传统女贞子的采收时间在每年冬至前后，此时女贞子果实呈紫黑色且饱满。但本研究显示，红景天苷含量随成熟度提高逐渐降低，其质量呈下降趋势，但其生物产量逐渐提高，故在综合考虑药材质量与其生物产量变化趋势的情况下，建议10月可作为浙产女贞子药材的适宜采收期。本试验建立了女贞子中红景天苷的质控方法，考察了浙江省内不同区域女贞子中红景天苷的含量，结果显示宁波地区平均含量最高，可为女贞子中红景天苷的开发提供依据。
参考文献：
[1] 仝会娟，胡魁伟.近十五年中药女贞子研究进展[J].中国实用医药， 2009，4（36）：1-3.
[2] 曹兰秀，周永学，顿宝生，等.女贞子总黄酮对高脂模型小鼠脂代谢的分子靶点的研究[J].中成药，2010，32（10）：1789.
[3] 黄新苹，王武朝.中药女贞子的化学成分研究进展[J].国际药学研究杂志，2011，38（1）：47.
[4] 蒋叶娟，姚卫峰，张丽，等.女贞子化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析[J].中国中药杂志，2012，37（15）：2304.
[5] 李梦.HPLC法测定女贞子中齐墩果酸的含量[J].安徽农业科学2008，36（24）：10519-10526.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：43.
[7] Department of Health， the Government of the Hong Kong Special Ad-minstrative Region of the People's Republic of China（香港特别行政区卫生署）.The Hong Kong Chinese Materia Standards （HKC-MMS） （香港中药材标准第三册）[M]. Hong Kong，2010：89.
[8] 黄雯，苏子仁，毕文川，等.HPLC法测定女贞子药材中女贞苷的含量[J].药物分析杂志，2009，29（5）：825-826.
[9] 李元圆，何玉铃，张永勋.HPLC法同时测定台湾市售女贞子中红景天苷女贞子苷的含量[J].药物分析杂志，2013，33（2）：230-233.
[10] 李泽运，陈晓辉，马风.HPLC法同时测定二至丸中红景天昔、女贞子昔和膨蟆菊内酝的含量[J].药物分析杂志，2011，31（1）：19.
[11] 郭娜，马芳，范斌.超高效液相色谱法测定女贞子不同炮制品中女贞苷含量[J].中国中医基础医学杂志，2010，16（12）：1171-1173.
[12] 李曼玲，徐丹.女贞子不同市售品，炮制品及不同果实部位中红景天苷的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（2）：14-15.
（收稿日期：2015-07-03）
（修回日期：2015-07-21；编辑：陈静）
摘要：目的 采用高效液相色谱法测定不同生长期、不同区域浙产女贞子中的红景天苷含量，为更合理、有效地从女贞子中提取红景天苷提供依据。方法 色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流动相：乙腈-水（10∶90）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。结果 红景天苷在0.71～3.55 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r=0.999 4）；加样回收率在95.6%～98.6%之间，平均加样回收率为96.88%，RSD=1.32%（n=5）。结论 红景天苷在女贞子中的含量随生长期延长逐渐下降，不同区域、不同采收期女贞子中红景天苷的含量不同。
关键词：女贞子；红景天苷；含量变化；区域差异；浙江
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0095-03
Study on Dynamic Changes and Regional Differences of Content of Salidroside in Ligustri Lucidi Fructus in Zhejiang Province CHENG Bin1，2， ZHOU Ai-zheng1， LING Qing-zhi1 （1. Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo 325035， China； 2. Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）
Abstract： Objective To determine content of Salidroside in Ligustri Lucidi Fructus at different growth stages and in different regions in Zhejiang Province by HPLC； To provide the basis for more rational， efficient extraction of Salidroside from Ligustri Lucidi Fructus. Methods The Kromasil C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was used with mobile phase of acetonitrile-water （10：90）； flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 220 nm； column temperature was set at room temperature； injection volume was 20 μL. Results Salidroside was in good linear range within 0.71–3.55 μg （r=0.999 4）. The recovery rate of Salidroside was 95.6%–98.6% and the average recovery rate was 96.88%， RSD was 1.32% （n=5）. Conclusion The content of Salidroside in Ligustri Lucidi Fructus gradually decreased with the extending of growing season. The contents of Salidroside were different at different growth stages and in different regions.
Key words： Ligustri Lucidi Fructus； Salidroside； content changes； regional differences； Zhejiang Province
红景天苷是景天科红景天属植物的主要有效成分之一，具有抗缺氧、保护心脑血管、抗肝纤维化等多种药理作用，作为药品、保健食品的原料得到广泛开发应用，但天然红景天植物资源逐渐匮乏，导致红景天苷价格昂贵，已成为其进一步开发利用的瓶颈。女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum Lucidum Ait.的干燥成熟果实，主产于浙江、江苏、安徽等地，为临床常用补虚药，味甘、苦，性凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发功效，常用于治疗肝肾阴虚引起的目暗不明、视力减退、须发早白。女贞子化学成分包括三萜类、黄酮类、裂环环烯醚萜类和对羟基苯乙醇
基金项目：浙江省教育厅一般科研项目（Y201226174）；高等学校访问工程师校企合作项目（FW2012004）；浙江医药高等专科学校校级科研课题（ZPCSR2010002）
苷类等化合物[1-2]，其中红景天苷含量可观，有望成为红景天苷的另一有效的天然来源[3-4]。且女贞子在浙江地区药材资源丰富，随着天然红景天植物资源逐渐匮乏，从女贞子中提取红景天苷具有较大的开发前景。
目前，2010年版《中华人民共和国药典》（一部）以特女贞苷为指标成分[5-6]，香港中药材标准以红景天苷为指标成分对女贞子进行质量控制[7]，表明红景天苷及裂环环烯醚萜苷类的含量代表了女贞子药材的内在质量。女贞子中红景天苷测定的方法已有报道[8-12]，本研究考察浙产女贞子不同成果期（9-12月）红景天苷含量的动态变化及浙江不同地区女贞子红景天苷含量的差异，从而确定女贞子的最佳采收时间及采收区域，为更合理、有效地从女贞子中提取红景天苷提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），HP色谱工作站（美国Agilent公司），Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），UV-2300扫描型紫外可见分光光度计（上海美谱达），JA2003N型电子天平（感量0.001 g，上海科技仪器公司），KQ-250E型医用超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。
红景天苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号110818-200404）；乙腈（山东禹王，色谱纯），水为自制高纯水，其余试剂均为分析纯。
分别在宁波、温州、衢州、湖州4个地区，于女贞子3个不同成果期（10、11、12月）采集女贞子药材，采样植物经浙江医药高等专科学校杨雄志教授鉴定为木犀科植物女贞Ligustrum Lucidum Ait.的干燥成熟果实。详见表1。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取红景天苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含红景天苷0.568 mg的对照品储备溶液；精密吸取浓度为0.568 mg/mL的红景天苷对照品储备液2.5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得红景天苷浓度为0.142 mg/mL的对照品溶液，低温避光贮藏，备用。
2.2 供试品溶液的制备
取女贞子干燥粉末，过3号筛，称取1.0 g样品，精密称定，置25 mL容量瓶中，加60%甲醇定容，密塞，摇匀，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，补足挥发的甲醇至刻度，密塞，摇匀，过膜，取续滤液，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙睛-水（10∶90）等度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：室温。分别吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL，按上述色谱条件进样，色谱图见图1。
2.4 线性关系考察
取“2.1”项下对照品溶液，分别进样5、10、15、20、25 ?L，在上述色谱条件下测定，以红景天苷进样量（μg）分别对相应峰面积积分值进行线性回归，得回归方程Y=2964.7X+1003.4（r=0.999 4），表明红景天苷在0.71～3.55 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取红景天苷浓度为0.142 mg/mL的对照品溶液20 μL，在上述色谱条件下连续重复进样6次；取上述对照品溶液在第1、2、3、4、5日分别进样测定，结果日内精密度峰面积的RSD=0.32%，日间精密度峰面积的RSD=0.47 %，表明红景天苷对照品溶液的日内精密度和日间精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一产地、同一生长期的女贞子样品（2号），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进样20 μL，测定，结果供试品溶液中红景天苷峰面积的RSD分别为0.29%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.7 重复性试验
取同一产地、同一生长期的女贞子样品（2号）5份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 ?L，测定。结果样品中红景天苷平均含量为3.084 mg/g，RSD=1.9%，表明重复性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的女贞子样品（2号）5份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.568 mg/mL的红景天苷对照品储备溶液2.6 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20 ?L，测定，计算加样回收率，结果红景天苷加样回收率在95.6%～98.6%之间，平均回收率为96.88 %，RSD=1.32%，符合要求，见表2。
3 讨论
全紫外波长扫描表明，红景天苷在220 nm波长处有较高吸收，峰面积的积分值较高，故此含量测定的检测波长为220 nm。分别以甲醇-水（20∶80）和乙腈-水（20∶80）作为流动相等度洗脱，考察不同流动相条件下样品中红景天苷的分离效果。结果表明，乙腈-水（20∶80）系统中，各峰均有较好的峰型，红景天苷响应良好，但分离度欠佳。故在此基础上调整两者的比例为乙腈-水（10∶90），结果显示，红景天苷有较好的分离度和响应值。
红景天苷极性大，易溶于甲醇、乙醇，因提取溶剂、浓度、方法对女贞子中红景天苷的溶出有很大影响，故本试验分别考察了不同提取溶剂（水、甲醇、乙醇）、提取方法（超声、回流）和浓度（60%、80%、100%）条件下女贞子中红景天苷的分离效果。结果表面，用60%甲醇超声提取，样品中红景天苷的峰型较好，峰面积较高，提取简便。
传统女贞子的采收时间在每年冬至前后，此时女贞子果实呈紫黑色且饱满。但本研究显示，红景天苷含量随成熟度提高逐渐降低，其质量呈下降趋势，但其生物产量逐渐提高，故在综合考虑药材质量与其生物产量变化趋势的情况下，建议10月可作为浙产女贞子药材的适宜采收期。本试验建立了女贞子中红景天苷的质控方法，考察了浙江省内不同区域女贞子中红景天苷的含量，结果显示宁波地区平均含量最高，可为女贞子中红景天苷的开发提供依据。
参考文献：
[1] 仝会娟，胡魁伟.近十五年中药女贞子研究进展[J].中国实用医药， 2009，4（36）：1-3.
[2] 曹兰秀，周永学，顿宝生，等.女贞子总黄酮对高脂模型小鼠脂代谢的分子靶点的研究[J].中成药，2010，32（10）：1789.
[3] 黄新苹，王武朝.中药女贞子的化学成分研究进展[J].国际药学研究杂志，2011，38（1）：47.
[4] 蒋叶娟，姚卫峰，张丽，等.女贞子化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析[J].中国中药杂志，2012，37（15）：2304.
[5] 李梦.HPLC法测定女贞子中齐墩果酸的含量[J].安徽农业科学2008，36（24）：10519-10526.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：43.
[7] Department of Health， the Government of the Hong Kong Special Ad-minstrative Region of the People's Republic of China（香港特别行政区卫生署）.The Hong Kong Chinese Materia Standards （HKC-MMS） （香港中药材标准第三册）[M]. Hong Kong，2010：89.
[8] 黄雯，苏子仁，毕文川，等.HPLC法测定女贞子药材中女贞苷的含量[J].药物分析杂志，2009，29（5）：825-826.
[9] 李元圆，何玉铃，张永勋.HPLC法同时测定台湾市售女贞子中红景天苷女贞子苷的含量[J].药物分析杂志，2013，33（2）：230-233.
[10] 李泽运，陈晓辉，马风.HPLC法同时测定二至丸中红景天昔、女贞子昔和膨蟆菊内酝的含量[J].药物分析杂志，2011，31（1）：19.
[11] 郭娜，马芳，范斌.超高效液相色谱法测定女贞子不同炮制品中女贞苷含量[J].中国中医基础医学杂志，2010，16（12）：1171-1173.
[12] 李曼玲，徐丹.女贞子不同市售品，炮制品及不同果实部位中红景天苷的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（2）：14-15.
（收稿日期：2015-07-03）
（修回日期：2015-07-21；编辑：陈静）
