电针肝俞、足三里对抑郁型功能性消化不良大鼠脑肠相互作用的研究
姜开妍 李海波 张可 郭晓苇 任路
摘要：目的 观察电针“肝俞”“足三里”对抑郁型功能性消化不良大鼠抑郁状态、胃肠动力及脑内相关蛋白表达的影响，探讨电针治疗抑郁型功能性消化不良的机制。方法 将48只雌性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、电针组和非穴组，每组12只。应用慢性不可预见性温和应激法建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型。于造模第15日开始，电针组每日予电针“肝俞”“足三里”干预，非穴组给予距尾尖1/3、2/3处电针刺激，干预14 d。于实验前1 d和实验第14、28日对各组大鼠进行体质量检测、旷场实验和蔗糖偏好实验；于取材前对各组大鼠进行黑色糊状物灌胃，40 min后检测大鼠胃内残留率和小肠推进率；Western blot检测大鼠外侧缰核βCaMKⅡ、海马脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白的表达。结果 与空白组比较，模型组和非穴组大鼠体质量、蔗糖偏好率、行为学评分、小肠推进率、海马BDNF表达明显下降（P<0.01），胃内残留率和外侧缰核βCaMKⅡ表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，电针组大鼠体质量、蔗糖偏好率、行为学评分、小肠推进率、海马BDNF表达明显升高（P<0.01），胃内残留率和外侧缰核βCaMKⅡ表达明显降低（P<0.01）；与非穴组比较，电针组大鼠外侧缰核βCaMKⅡ表达量显著降低、海马组织BDNF表达量显著增加（P<0.01）。结论 电针“肝俞”“足三里”可改善抑郁型功能性消化不良大鼠的抑郁状态和胃肠动力。
关键词：抑郁型功能性消化不良；电针；肝俞；足三里；βCaMKⅡ；脑源性神经营养因子；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.017
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0062-05
Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture at Ganshu （BL18） and Zusanli （ST36） on depression state and gastrointestinal motility and relevant protein expressions in brain of rats with stress-induced depressive functional dyspepsia. Methods Totally 48 Wistar rats were randomly divided into normal， model， electroacupuncture （EA） and sham-operation group， with 12 rats in each group. Depressive functional dyspepsia model was established by chronic unpredictable mild stress protocols. From day 15 to day 28， the EA group was given electroacupuncture at BL18 and ST36， and the sham-operation group was stimulated by electroacupuncture at 1/3 and 2/3 of the tail. Body weight test， open field test and sucrose preference test were measured on day 0， day 14 and day 28. After 14-day administration， gastric residual volume and intestinal propulsion rate of semisolid paste were detected. The expression of βCaMKⅡin lateral habenulas and BDNF in hippocampus were measured by Western blot. Results Compared with the normal group， the weight， the sucrose preference rate， the behavior score， the small intestinal propulsion rate of semisolid paste and the expression of BDNF in hippocampus decreased significantly both in the model group and sham-operation group （P<0.01）， and the gastric residual volume of semisolid paste and the expression of βCaMKⅡin lateral habenulas increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the weight， the sucrose preference rate， the behavior score， the small intestinal propulsion rate of semisolid paste and the expression of BDNF in hippocampus increased significantly in EA group （P<0.01）， and the gastric residual volume of semisolid paste and the expression of βCaMKⅡin lateral habenulas decreased significantly （P<0.01）. Compared with the sham-operation group， the expression of βCaMKⅡ in lateral habenulas decreased significantly， the expression of BDNF in hippocampus increased significantly in EA group （P<0.01）. Conclusion Electroacupuncture at Ganshu （BL18） and Zusanli （ST36） can improve depression and gastrointestinal motility of rats with depressive functional dyspepsia， which may be related to the inhibition of βCaMKⅡin lateral habenulas and the activation of BDNF in hippocampus dyspepsia.
Key words： depressive functional dyspepsia； electroacupuncture； Ganshu （BL18）； Zusanli （ST36）； βCaMKⅡ； BDNF； rats
功能性消化不良是一种常见的慢性非器质性胃肠功能紊乱性疾病，临床表现主要为嗳气、厌食、腹胀、腹痛等。目前，西药治疗多采用促进胃动力药物，虽然能有效缓解症状，但具有较高的复发率，并且有部分患者对药物治疗无效，给患者生活质量带来明显的影响。本实验通过模拟人类每日应激引起抑郁状态和胃肠不适的方法，建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型，观察电针对模型大鼠的抑郁状态及胃肠动力的影响，检测外侧缰核βCaMKⅡ及海马脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白的表达，探讨电针对抑郁型功能性消化不良的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
7～8周龄SPF级雌性Wistar大鼠48只，体质量180～210 g，辽宁长生生物技术有限公司，合格证号SCXK（辽）2010-0001。动物饲养于辽宁中医药大学动物实验中心屏障环境。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。
1.2 主要试剂与仪器
羧甲基纤维素钠（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），βCaMKⅡ一抗（Santa，C-20），BDNF一抗（Santa，N-20），β-actin一抗（Santa，C-4），羊抗鼠二抗（Santa，sc-2005），羊抗兔二抗（Santa，sc-2004），兔抗羊二抗（Santa，sc-2768）。电针仪（6805D，广州汕头市医用设备厂），华佗牌一次性无菌针灸针（0.25 mm×13 mm），自制旷场箱（100 cm×100 cm×40 cm），恒温振荡器（国华企业，SHA-C），高通量组织研磨仪（Thmorgan，CK1000D），台式高速冷冻离心机（Heal Force，Neofuge 13R），酶标仪（BIO-RAD，iMark），稳压稳流电泳仪（Tanon，EPS300）。
1.3 分组及造模
大鼠适应性饲养7 d后，经旷场实验测定，48只成年大鼠旷场评分相近，将其随机分为空白组、模型组、电针组和非穴组，每组12只。采用慢性不可预见性温和应激（CUMS）法[1]建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型。除空白组外，其余各组大鼠在4周内每日以2～3次的频率交替接受以下刺激：禁食24 h、禁水24 h、热刺激5 min、冷刺激5 min、湿笼24 h、置于空笼24 h、倾斜笼45°24 h、噪音刺激2 min、明暗颠倒24 h、夹尾3 min。相邻2 d不施以同种刺激。
1.4 干预措施
从造模第3周开始对各组施以相应干预措施。模型组给予抓取固定刺激，电针组大鼠进行电针治疗。安静环境中，将大鼠躯干固定于自制木板上，选择6805D型电针仪，疏密波型，疏波4 Hz，密波20 Hz，强度以局部肌肉轻微颤动为度，每次15 min，每日1次，连续干预14 d。穴位定位参照《实验针灸学》[1]，并参考比较解剖学和模拟人体经穴定位法进行大鼠穴位定位。“肝俞”位于大鼠第9胸椎下两旁肋间，旁开约5 mm，左右两侧各1穴，直刺6 mm；“足三里”位于膝关节下方，腓骨小头下缘约5 mm处，左右两侧各1穴，直刺5 mm。非穴位组大鼠进行非穴位电针干预，在距离大鼠尾尖1/3、2/3处给予电针刺激[2]，其余条件同电针组。
1.5 检测指标
1.5.1 体质量检测 分别于实验前1 d和实验第14、28日测量大鼠体质量，以此来衡量大鼠是否出现类似于人类的食欲不振、体质量降低等抑郁型功能性消化不良的症状。
1.5.2 行为学检测 分别于实验前1 d和实验第14、28日对大鼠进行行为学检测，包括旷场实验、蔗糖偏好实验，作为评价造模成功与否及干预效果的行为学参照。
1.5.2.1 旷场实验 在安静的实验室，对大鼠进行单只观察，将大鼠置于100 cm×100 cm×40 cm四周涂黑的无盖木制方箱，方箱底面划分成20 cm×20 cm的25个方格。每只大鼠被放置在场箱最中央的方格中，观察记录其3 min内的活动。评分标准：大鼠水平穿越方格数以四肢全部跨入邻格为1格，爬行1格记水平得1分；大鼠前肢全部离开水平地面，仅后爪着地为站立，自大鼠前肢全部离开地面至四肢着地为站立1次，站立1次记垂直得1分。
1.5.2.2 蔗糖偏好实验 参照文献[3]，在该实验前训练大鼠适应饮用蔗糖水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，2瓶均装有1%蔗糖水，第2个24 h，1瓶为1%蔗糖水，1瓶为灭菌水。正式检测时，大鼠禁食禁水24 h后同时给予每只大鼠事先称好质量的1%蔗糖水和灭菌水各1瓶。30 min更换位置，1 h后取走水瓶进行称量，计算每只大鼠蔗糖偏好率[糖水消耗量÷（糖水消耗量+灭菌水消耗量）×100%]。
1.5.3 小肠推进率及胃内残留率检测 半固体营养糊的制备[4]：5 g羧甲基纤维素钠溶于125 mL蒸馏水中，再分别加8 g奶粉、4 g白糖、4 g淀粉和2 g活性炭末，一边搅拌一边再加蒸馏水配制成150 mL黑色半固体糊状物（约1 g/mL）。大鼠取材前给予半固体糊状物2 mL灌胃，40 min后10%水合氯醛麻醉，打开腹腔，将胃贲门和幽门部结扎，取胃，称量胃全重，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内残留物后将水擦干，称量胃净重。胃全重与胃净重之差即为胃内残留物质量，计算胃内残留率（胃内残留物质量÷所灌胃黑色半固体糊状物质量×100%）。同时分离肠系膜，剪取幽门至回盲部的肠管，置于白纸上，轻轻拉成直线，测量肠管长度为小肠总长度，从幽门至黑色半固体糊状物前沿的距离为其在小肠内推进的距离，计算小肠推进率（糊状物在小肠推进的距离÷小肠总长度×100%）[5]。
1.5.4 Western blot检测外侧缰核βCaMKⅡ及海马脑源性神经营养因子蛋白表达 在冰上迅速剥离大鼠大脑，分离出海马和外侧缰核部位。提取大鼠海马与外侧缰核部位蛋白，BCA法进行蛋白定量。各取50 μg蛋白，加上样缓冲液后煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白湿转至NC膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加一抗（稀释比例均为1∶200），4 ℃过夜，用TBST洗膜5次，每次5 min。加相应二抗（按1∶5000稀释），室温孵育2 h，TBST洗膜5次×5 min。经ECL显色，暗室曝光得到X光胶片。应用Image J图像分析软件分析光密度值。采用目的蛋白与内参蛋白条带光密度值的比值作为结果进行分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.01表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 电针对大鼠体质量的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠体质量下降（P<0.01）；实验第28日电针组大鼠体质量显著高于模型组（P<0.01），而非穴组大鼠体质量与模型组相近（P>0.05）；电针组体质量显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表1。
2.2 电针对大鼠旷场实验水平得分的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠水平得分均显著降低（P<0.01）；实验第28日与空白组比较，模型组大鼠水平得分显著降低（P<0.01），电针组大鼠水平得分显著高于模型组（P<0.01），电针组水平得分显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表2。
2.3 电针对大鼠旷场实验垂直得分的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠垂直得分均显著降低（P<0.01）；实验第28日与空白组比较，模型组和非穴组大鼠垂直得分显著降低（P<0.01），电针组大鼠垂直得分显著高于模型组（P<0.01），电针组垂直得分显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表3。
2.4 电针对大鼠蔗糖偏好率的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠蔗糖偏好率均明显下降（P<0.01）；实验第28日与空白组比较，模型组和非穴组大鼠蔗糖偏好率均明显下降（P<0.01），电针组大鼠蔗糖偏好率显著高于模型组（P<0.01），电针组蔗糖偏好率显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表4。
2.5 电针对大鼠胃内残留率及小肠推进率的影响
模型组和非穴组大鼠胃内残留率明显高于空白组（P<0.01）；电针组胃内残留率与模型组比较显著降低（P<0.01）；电针组大鼠胃内残留率显著低于非穴组（P<0.01）；模型组与非穴组大鼠胃内残留率无明显差异（P>0.05）。模型组和非穴位组大鼠小肠推进率明显低于空白组（P<0.01）；电针组小肠推进率明显高于模型组（P<0.01）；电针组大鼠小肠推进率显著高于非穴组（P<0.01）；模型组与非穴组大鼠小肠推进率无明显差异（P>0.05）。结果见表5。
2.6 电针对大鼠外侧缰核βCaMKⅡ和海马脑源性神经营养因子表达的影响
各组大鼠外侧缰核组织βCaMKⅡ和海马组织BDNF的表达均以β-actin作为内参。与空白组比较，模型组和非穴组大鼠外侧缰核组织βCaMKⅡ的表达量明显增多、海马组织BDNF表达量显著减少（P<0.01）；与模型组比较，电针组大鼠外侧缰核组织βCaMKⅡ表达量显著降低、海马组织BDNF表达量显著增加（P<0.01）；与非穴组比较，电针组大鼠外侧缰核βCaMKⅡ表达量显著降低、海马组织BDNF表达量显著增加（P<0.01）。结果见图1、表6。
3 讨论
功能性消化不良属中医“痞满”“胃脘痛”等范畴，病变脏腑在肝、脾、胃。中医认为情志不遂、忧思恼怒、肝郁气滞是功能性消化不良发病的主要机制之一。若怒气伤肝，肝失疏泄，而致肝郁气滞，肝木克脾土，影响脾胃升降功能，则中焦气机壅滞，升降失常，形成痞满，发生功能性消化不良。可见，情志与功能性消化不良的发生有着密切的关系。而临床上抑郁症患者常伴随有身体不适感，其中上腹部不适为主要症状之一。表明抑郁状态与功能性消化不良的发生有着密切的联系。肝主疏泄、主情志，肝俞作为肝脏的背俞穴，可调控全身气机；足三里属多气多血的足阳明胃经，与肝俞相配可更好地发挥疏肝解郁、调和脾胃的功效。
临床调查发现功能性消化不良患者普遍存在焦虑、抑郁情绪[6]。而胃部不适也是许多抑郁症患者首诊的主要不适症状之一[7]。有研究表明，采用抗抑郁药物治疗功能性消化不良，能有效改善精神和躯体两方面症状[8-9]。由此可见，功能性消化不良与抑郁的发生密切相关。现代研究表明，针刺足三里对胃的运动及分泌功能有明显的调整作用，能使原来处于紧张或收缩亢进的胃运动减弱，使原来处于弛缓状态或较低兴奋状态的胃运动增强。对正常人针刺足三里，多数可使胃蠕动加强。并有研究表明，电针足三里可改善抑郁症大鼠的异常行为[10]。
从体质量变化和旷场实验结果可以看出，在造模第14日，与空白组比较，其余3组大鼠体质量、水平和垂直得分明显减少，说明大鼠在新奇环境中自主行为、探究行为有所减少，体质量增长的减少说明模型大鼠出现了类似功能性消化不良患者食欲减退、体质量减轻的症状。经电针治疗后，大鼠体质量、水平和垂直得分较模型组、非穴组增加，说明电针“肝俞”“足三里”可改善模型大鼠的行为状态。蔗糖偏好实验是根据动物对甜味的偏好而设计的一种检测方法，当大鼠出现抑郁样行为时，对奖赏的反应性也下降，表现为对蔗糖的偏嗜度降低，此结果反映了抑郁症的核心症状——快感缺失，即是体验快乐的能力下降。结果显示，模型组大鼠糖水偏好率明显低于空白组，说明模型大鼠发生了快感缺失，经过电针的干预，蔗糖偏好率有所恢复，说明电针对抑郁的快感缺失症状有治疗作用。
胃肠动力异常是功能性消化不良病理生理机制中主要的研究主题之一，一半以上的功能性消化不良患者有胃肠动力异常的症状，如胃排空异常、胃窦动力低下、十二指肠动力改变等。本实验通过对大鼠胃内残留率及小肠推进率的测量检验CUMS法对大鼠胃肠动力的影响，从而综合判断抑郁型功能性消化不良模型建立成功与否。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠胃内残留率增高，小肠推进率降低，说明模型大鼠的胃肠运动减缓，发生异常。这与临床抑郁症患者多伴有功能性消化疾病相似，抑郁型功能性消化不良大鼠模型建立成功。
外侧缰核属于上丘脑的一部分。它位于海马下方、丘脑上方，是连接前脑边缘系统和中脑单胺中心的核心枢纽。研究发现，外侧缰核的βCaMKⅡ介导了抑郁的发生，在天生抑郁大鼠的外侧缰核中，研究人员抑制βCaMKⅡ的表达后大鼠的抑郁状态改善。而外侧缰核的激活能够抑制海马组织的活性，在抑郁患者和抑郁小鼠均发现海马BDNF的含量表达下降[12-13]。本实验结果显示，CUMS模型大鼠外侧缰核βCaMKⅡ表达升高，海马BDNF表达降低。而电针肝俞、足三里能通过降低外侧缰核βCaMKⅡ的活性，激活海马内BDNF，从而改善抑郁状态。
参考文献：
[1] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2007：253-255.
[2] LEE B， SUR BJ， KWON S， et al. Acupuncture stimulation alleviates corticosterone-induced impairments of spatial memory and cholinergic neurons in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：670536.
[3] BENELLI A， FILAFERRO M， BERTOLINI A， et al. Influence of S-adenosyl-L-methionine on chronic mild stress-induced anhedonia in castrated rats[J]. Brit J of Pharmacol，1999，127（3）：645-654.
[4] 郁保生，张国山，石晓理，等.小柴胡汤对功能性消化不良大鼠血管活性肠肽、胃排空及小肠推进率的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013， 19（8）：251-254.
[5] 韩棉梅，梁嘉恺，陶双友，等.四磨汤口服液对胃肠运动功能障碍模型大鼠胃残留、小肠推进率及结肠P物质的影响[J].新中医，2011，43（12）：114-115.
[6] 刘燕，王春艳，刘敏，等.功能性消化不良患者焦虑抑郁情绪现状和影响因素调查研究[J].河北医学，2013，19（7）：988-991.
[7] 朱祥路，谢平霞，李鹏，等.“躯体不适感”在精神心理疾病症状学中的诊断意义[J].中国临床康复，2005，9（36）：30-32.
[8] 李懿璇，王化虹.抗抑郁药治疗功能性消化不良的Meta分析[J].中国药物评价，2012，29（1）：35-40.
[9] 潘小平，李瑜元，沙卫红，等.抗抑郁药治疗功能性消化不良的临床研究[J].中华消化杂志，1999，19（3）：17-19.
[10] 吴爱群，党瑞山，周强，等.电针足三里对慢性不可预见性抑郁症大鼠多器官损伤的作用及其机制[J].解剖学杂志，2007，30（5）：538-541.
[11] LI K， ZHOU T， LIAO L， et al. CaMKⅡ in lateral habenula mediates core symptoms of depression[J]. Science，2013，341（6149）：1016- 1020.
[12] MARTINOWICH K， MANJI H， LU B. New insights into BDNF function in depression and anxiety[J]. Nat Neurosci，2007，10（9）：1089-1093.
[13] GREENWOOD B N， STRONG P V， FOLEY T E， et al. Learned helplessness is independent of levels of brain-derived neurotrophic factor in the hippocampus[J]. Neuroscience，2007，144（4）：1193-1120.
（收稿日期：2015-05-10）
（修回日期：2015-06-30；编辑：华强）
摘要：目的 观察电针“肝俞”“足三里”对抑郁型功能性消化不良大鼠抑郁状态、胃肠动力及脑内相关蛋白表达的影响，探讨电针治疗抑郁型功能性消化不良的机制。方法 将48只雌性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、电针组和非穴组，每组12只。应用慢性不可预见性温和应激法建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型。于造模第15日开始，电针组每日予电针“肝俞”“足三里”干预，非穴组给予距尾尖1/3、2/3处电针刺激，干预14 d。于实验前1 d和实验第14、28日对各组大鼠进行体质量检测、旷场实验和蔗糖偏好实验；于取材前对各组大鼠进行黑色糊状物灌胃，40 min后检测大鼠胃内残留率和小肠推进率；Western blot检测大鼠外侧缰核βCaMKⅡ、海马脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白的表达。结果 与空白组比较，模型组和非穴组大鼠体质量、蔗糖偏好率、行为学评分、小肠推进率、海马BDNF表达明显下降（P<0.01），胃内残留率和外侧缰核βCaMKⅡ表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，电针组大鼠体质量、蔗糖偏好率、行为学评分、小肠推进率、海马BDNF表达明显升高（P<0.01），胃内残留率和外侧缰核βCaMKⅡ表达明显降低（P<0.01）；与非穴组比较，电针组大鼠外侧缰核βCaMKⅡ表达量显著降低、海马组织BDNF表达量显著增加（P<0.01）。结论 电针“肝俞”“足三里”可改善抑郁型功能性消化不良大鼠的抑郁状态和胃肠动力。
关键词：抑郁型功能性消化不良；电针；肝俞；足三里；βCaMKⅡ；脑源性神经营养因子；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.017
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0062-05
Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture at Ganshu （BL18） and Zusanli （ST36） on depression state and gastrointestinal motility and relevant protein expressions in brain of rats with stress-induced depressive functional dyspepsia. Methods Totally 48 Wistar rats were randomly divided into normal， model， electroacupuncture （EA） and sham-operation group， with 12 rats in each group. Depressive functional dyspepsia model was established by chronic unpredictable mild stress protocols. From day 15 to day 28， the EA group was given electroacupuncture at BL18 and ST36， and the sham-operation group was stimulated by electroacupuncture at 1/3 and 2/3 of the tail. Body weight test， open field test and sucrose preference test were measured on day 0， day 14 and day 28. After 14-day administration， gastric residual volume and intestinal propulsion rate of semisolid paste were detected. The expression of βCaMKⅡin lateral habenulas and BDNF in hippocampus were measured by Western blot. Results Compared with the normal group， the weight， the sucrose preference rate， the behavior score， the small intestinal propulsion rate of semisolid paste and the expression of BDNF in hippocampus decreased significantly both in the model group and sham-operation group （P<0.01）， and the gastric residual volume of semisolid paste and the expression of βCaMKⅡin lateral habenulas increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the weight， the sucrose preference rate， the behavior score， the small intestinal propulsion rate of semisolid paste and the expression of BDNF in hippocampus increased significantly in EA group （P<0.01）， and the gastric residual volume of semisolid paste and the expression of βCaMKⅡin lateral habenulas decreased significantly （P<0.01）. Compared with the sham-operation group， the expression of βCaMKⅡ in lateral habenulas decreased significantly， the expression of BDNF in hippocampus increased significantly in EA group （P<0.01）. Conclusion Electroacupuncture at Ganshu （BL18） and Zusanli （ST36） can improve depression and gastrointestinal motility of rats with depressive functional dyspepsia， which may be related to the inhibition of βCaMKⅡin lateral habenulas and the activation of BDNF in hippocampus dyspepsia.
Key words： depressive functional dyspepsia； electroacupuncture； Ganshu （BL18）； Zusanli （ST36）； βCaMKⅡ； BDNF； rats
功能性消化不良是一种常见的慢性非器质性胃肠功能紊乱性疾病，临床表现主要为嗳气、厌食、腹胀、腹痛等。目前，西药治疗多采用促进胃动力药物，虽然能有效缓解症状，但具有较高的复发率，并且有部分患者对药物治疗无效，给患者生活质量带来明显的影响。本实验通过模拟人类每日应激引起抑郁状态和胃肠不适的方法，建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型，观察电针对模型大鼠的抑郁状态及胃肠动力的影响，检测外侧缰核βCaMKⅡ及海马脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白的表达，探讨电针对抑郁型功能性消化不良的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
7～8周龄SPF级雌性Wistar大鼠48只，体质量180～210 g，辽宁长生生物技术有限公司，合格证号SCXK（辽）2010-0001。动物饲养于辽宁中医药大学动物实验中心屏障环境。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。
1.2 主要试剂与仪器
羧甲基纤维素钠（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），βCaMKⅡ一抗（Santa，C-20），BDNF一抗（Santa，N-20），β-actin一抗（Santa，C-4），羊抗鼠二抗（Santa，sc-2005），羊抗兔二抗（Santa，sc-2004），兔抗羊二抗（Santa，sc-2768）。电针仪（6805D，广州汕头市医用设备厂），华佗牌一次性无菌针灸针（0.25 mm×13 mm），自制旷场箱（100 cm×100 cm×40 cm），恒温振荡器（国华企业，SHA-C），高通量组织研磨仪（Thmorgan，CK1000D），台式高速冷冻离心机（Heal Force，Neofuge 13R），酶标仪（BIO-RAD，iMark），稳压稳流电泳仪（Tanon，EPS300）。
1.3 分组及造模
大鼠适应性饲养7 d后，经旷场实验测定，48只成年大鼠旷场评分相近，将其随机分为空白组、模型组、电针组和非穴组，每组12只。采用慢性不可预见性温和应激（CUMS）法[1]建立抑郁型功能性消化不良大鼠模型。除空白组外，其余各组大鼠在4周内每日以2～3次的频率交替接受以下刺激：禁食24 h、禁水24 h、热刺激5 min、冷刺激5 min、湿笼24 h、置于空笼24 h、倾斜笼45°24 h、噪音刺激2 min、明暗颠倒24 h、夹尾3 min。相邻2 d不施以同种刺激。
1.4 干预措施
从造模第3周开始对各组施以相应干预措施。模型组给予抓取固定刺激，电针组大鼠进行电针治疗。安静环境中，将大鼠躯干固定于自制木板上，选择6805D型电针仪，疏密波型，疏波4 Hz，密波20 Hz，强度以局部肌肉轻微颤动为度，每次15 min，每日1次，连续干预14 d。穴位定位参照《实验针灸学》[1]，并参考比较解剖学和模拟人体经穴定位法进行大鼠穴位定位。“肝俞”位于大鼠第9胸椎下两旁肋间，旁开约5 mm，左右两侧各1穴，直刺6 mm；“足三里”位于膝关节下方，腓骨小头下缘约5 mm处，左右两侧各1穴，直刺5 mm。非穴位组大鼠进行非穴位电针干预，在距离大鼠尾尖1/3、2/3处给予电针刺激[2]，其余条件同电针组。
1.5 检测指标
1.5.1 体质量检测 分别于实验前1 d和实验第14、28日测量大鼠体质量，以此来衡量大鼠是否出现类似于人类的食欲不振、体质量降低等抑郁型功能性消化不良的症状。
1.5.2 行为学检测 分别于实验前1 d和实验第14、28日对大鼠进行行为学检测，包括旷场实验、蔗糖偏好实验，作为评价造模成功与否及干预效果的行为学参照。
1.5.2.1 旷场实验 在安静的实验室，对大鼠进行单只观察，将大鼠置于100 cm×100 cm×40 cm四周涂黑的无盖木制方箱，方箱底面划分成20 cm×20 cm的25个方格。每只大鼠被放置在场箱最中央的方格中，观察记录其3 min内的活动。评分标准：大鼠水平穿越方格数以四肢全部跨入邻格为1格，爬行1格记水平得1分；大鼠前肢全部离开水平地面，仅后爪着地为站立，自大鼠前肢全部离开地面至四肢着地为站立1次，站立1次记垂直得1分。
1.5.2.2 蔗糖偏好实验 参照文献[3]，在该实验前训练大鼠适应饮用蔗糖水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，2瓶均装有1%蔗糖水，第2个24 h，1瓶为1%蔗糖水，1瓶为灭菌水。正式检测时，大鼠禁食禁水24 h后同时给予每只大鼠事先称好质量的1%蔗糖水和灭菌水各1瓶。30 min更换位置，1 h后取走水瓶进行称量，计算每只大鼠蔗糖偏好率[糖水消耗量÷（糖水消耗量+灭菌水消耗量）×100%]。
1.5.3 小肠推进率及胃内残留率检测 半固体营养糊的制备[4]：5 g羧甲基纤维素钠溶于125 mL蒸馏水中，再分别加8 g奶粉、4 g白糖、4 g淀粉和2 g活性炭末，一边搅拌一边再加蒸馏水配制成150 mL黑色半固体糊状物（约1 g/mL）。大鼠取材前给予半固体糊状物2 mL灌胃，40 min后10%水合氯醛麻醉，打开腹腔，将胃贲门和幽门部结扎，取胃，称量胃全重，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内残留物后将水擦干，称量胃净重。胃全重与胃净重之差即为胃内残留物质量，计算胃内残留率（胃内残留物质量÷所灌胃黑色半固体糊状物质量×100%）。同时分离肠系膜，剪取幽门至回盲部的肠管，置于白纸上，轻轻拉成直线，测量肠管长度为小肠总长度，从幽门至黑色半固体糊状物前沿的距离为其在小肠内推进的距离，计算小肠推进率（糊状物在小肠推进的距离÷小肠总长度×100%）[5]。
1.5.4 Western blot检测外侧缰核βCaMKⅡ及海马脑源性神经营养因子蛋白表达 在冰上迅速剥离大鼠大脑，分离出海马和外侧缰核部位。提取大鼠海马与外侧缰核部位蛋白，BCA法进行蛋白定量。各取50 μg蛋白，加上样缓冲液后煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白湿转至NC膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加一抗（稀释比例均为1∶200），4 ℃过夜，用TBST洗膜5次，每次5 min。加相应二抗（按1∶5000稀释），室温孵育2 h，TBST洗膜5次×5 min。经ECL显色，暗室曝光得到X光胶片。应用Image J图像分析软件分析光密度值。采用目的蛋白与内参蛋白条带光密度值的比值作为结果进行分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.01表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 电针对大鼠体质量的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠体质量下降（P<0.01）；实验第28日电针组大鼠体质量显著高于模型组（P<0.01），而非穴组大鼠体质量与模型组相近（P>0.05）；电针组体质量显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表1。
2.2 电针对大鼠旷场实验水平得分的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠水平得分均显著降低（P<0.01）；实验第28日与空白组比较，模型组大鼠水平得分显著降低（P<0.01），电针组大鼠水平得分显著高于模型组（P<0.01），电针组水平得分显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表2。
2.3 电针对大鼠旷场实验垂直得分的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠垂直得分均显著降低（P<0.01）；实验第28日与空白组比较，模型组和非穴组大鼠垂直得分显著降低（P<0.01），电针组大鼠垂直得分显著高于模型组（P<0.01），电针组垂直得分显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表3。
2.4 电针对大鼠蔗糖偏好率的影响
实验第14日与空白组比较，其余各组大鼠蔗糖偏好率均明显下降（P<0.01）；实验第28日与空白组比较，模型组和非穴组大鼠蔗糖偏好率均明显下降（P<0.01），电针组大鼠蔗糖偏好率显著高于模型组（P<0.01），电针组蔗糖偏好率显著高于非穴组（P<0.01）。结果见表4。
2.5 电针对大鼠胃内残留率及小肠推进率的影响
模型组和非穴组大鼠胃内残留率明显高于空白组（P<0.01）；电针组胃内残留率与模型组比较显著降低（P<0.01）；电针组大鼠胃内残留率显著低于非穴组（P<0.01）；模型组与非穴组大鼠胃内残留率无明显差异（P>0.05）。模型组和非穴位组大鼠小肠推进率明显低于空白组（P<0.01）；电针组小肠推进率明显高于模型组（P<0.01）；电针组大鼠小肠推进率显著高于非穴组（P<0.01）；模型组与非穴组大鼠小肠推进率无明显差异（P>0.05）。结果见表5。
2.6 电针对大鼠外侧缰核βCaMKⅡ和海马脑源性神经营养因子表达的影响
各组大鼠外侧缰核组织βCaMKⅡ和海马组织BDNF的表达均以β-actin作为内参。与空白组比较，模型组和非穴组大鼠外侧缰核组织βCaMKⅡ的表达量明显增多、海马组织BDNF表达量显著减少（P<0.01）；与模型组比较，电针组大鼠外侧缰核组织βCaMKⅡ表达量显著降低、海马组织BDNF表达量显著增加（P<0.01）；与非穴组比较，电针组大鼠外侧缰核βCaMKⅡ表达量显著降低、海马组织BDNF表达量显著增加（P<0.01）。结果见图1、表6。
3 讨论
功能性消化不良属中医“痞满”“胃脘痛”等范畴，病变脏腑在肝、脾、胃。中医认为情志不遂、忧思恼怒、肝郁气滞是功能性消化不良发病的主要机制之一。若怒气伤肝，肝失疏泄，而致肝郁气滞，肝木克脾土，影响脾胃升降功能，则中焦气机壅滞，升降失常，形成痞满，发生功能性消化不良。可见，情志与功能性消化不良的发生有着密切的关系。而临床上抑郁症患者常伴随有身体不适感，其中上腹部不适为主要症状之一。表明抑郁状态与功能性消化不良的发生有着密切的联系。肝主疏泄、主情志，肝俞作为肝脏的背俞穴，可调控全身气机；足三里属多气多血的足阳明胃经，与肝俞相配可更好地发挥疏肝解郁、调和脾胃的功效。
临床调查发现功能性消化不良患者普遍存在焦虑、抑郁情绪[6]。而胃部不适也是许多抑郁症患者首诊的主要不适症状之一[7]。有研究表明，采用抗抑郁药物治疗功能性消化不良，能有效改善精神和躯体两方面症状[8-9]。由此可见，功能性消化不良与抑郁的发生密切相关。现代研究表明，针刺足三里对胃的运动及分泌功能有明显的调整作用，能使原来处于紧张或收缩亢进的胃运动减弱，使原来处于弛缓状态或较低兴奋状态的胃运动增强。对正常人针刺足三里，多数可使胃蠕动加强。并有研究表明，电针足三里可改善抑郁症大鼠的异常行为[10]。
从体质量变化和旷场实验结果可以看出，在造模第14日，与空白组比较，其余3组大鼠体质量、水平和垂直得分明显减少，说明大鼠在新奇环境中自主行为、探究行为有所减少，体质量增长的减少说明模型大鼠出现了类似功能性消化不良患者食欲减退、体质量减轻的症状。经电针治疗后，大鼠体质量、水平和垂直得分较模型组、非穴组增加，说明电针“肝俞”“足三里”可改善模型大鼠的行为状态。蔗糖偏好实验是根据动物对甜味的偏好而设计的一种检测方法，当大鼠出现抑郁样行为时，对奖赏的反应性也下降，表现为对蔗糖的偏嗜度降低，此结果反映了抑郁症的核心症状——快感缺失，即是体验快乐的能力下降。结果显示，模型组大鼠糖水偏好率明显低于空白组，说明模型大鼠发生了快感缺失，经过电针的干预，蔗糖偏好率有所恢复，说明电针对抑郁的快感缺失症状有治疗作用。
胃肠动力异常是功能性消化不良病理生理机制中主要的研究主题之一，一半以上的功能性消化不良患者有胃肠动力异常的症状，如胃排空异常、胃窦动力低下、十二指肠动力改变等。本实验通过对大鼠胃内残留率及小肠推进率的测量检验CUMS法对大鼠胃肠动力的影响，从而综合判断抑郁型功能性消化不良模型建立成功与否。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠胃内残留率增高，小肠推进率降低，说明模型大鼠的胃肠运动减缓，发生异常。这与临床抑郁症患者多伴有功能性消化疾病相似，抑郁型功能性消化不良大鼠模型建立成功。
外侧缰核属于上丘脑的一部分。它位于海马下方、丘脑上方，是连接前脑边缘系统和中脑单胺中心的核心枢纽。研究发现，外侧缰核的βCaMKⅡ介导了抑郁的发生，在天生抑郁大鼠的外侧缰核中，研究人员抑制βCaMKⅡ的表达后大鼠的抑郁状态改善。而外侧缰核的激活能够抑制海马组织的活性，在抑郁患者和抑郁小鼠均发现海马BDNF的含量表达下降[12-13]。本实验结果显示，CUMS模型大鼠外侧缰核βCaMKⅡ表达升高，海马BDNF表达降低。而电针肝俞、足三里能通过降低外侧缰核βCaMKⅡ的活性，激活海马内BDNF，从而改善抑郁状态。
参考文献：
[1] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2007：253-255.
[2] LEE B， SUR BJ， KWON S， et al. Acupuncture stimulation alleviates corticosterone-induced impairments of spatial memory and cholinergic neurons in rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：670536.
[3] BENELLI A， FILAFERRO M， BERTOLINI A， et al. Influence of S-adenosyl-L-methionine on chronic mild stress-induced anhedonia in castrated rats[J]. Brit J of Pharmacol，1999，127（3）：645-654.
[4] 郁保生，张国山，石晓理，等.小柴胡汤对功能性消化不良大鼠血管活性肠肽、胃排空及小肠推进率的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013， 19（8）：251-254.
[5] 韩棉梅，梁嘉恺，陶双友，等.四磨汤口服液对胃肠运动功能障碍模型大鼠胃残留、小肠推进率及结肠P物质的影响[J].新中医，2011，43（12）：114-115.
[6] 刘燕，王春艳，刘敏，等.功能性消化不良患者焦虑抑郁情绪现状和影响因素调查研究[J].河北医学，2013，19（7）：988-991.
[7] 朱祥路，谢平霞，李鹏，等.“躯体不适感”在精神心理疾病症状学中的诊断意义[J].中国临床康复，2005，9（36）：30-32.
[8] 李懿璇，王化虹.抗抑郁药治疗功能性消化不良的Meta分析[J].中国药物评价，2012，29（1）：35-40.
[9] 潘小平，李瑜元，沙卫红，等.抗抑郁药治疗功能性消化不良的临床研究[J].中华消化杂志，1999，19（3）：17-19.
[10] 吴爱群，党瑞山，周强，等.电针足三里对慢性不可预见性抑郁症大鼠多器官损伤的作用及其机制[J].解剖学杂志，2007，30（5）：538-541.
[11] LI K， ZHOU T， LIAO L， et al. CaMKⅡ in lateral habenula mediates core symptoms of depression[J]. Science，2013，341（6149）：1016- 1020.
[12] MARTINOWICH K， MANJI H， LU B. New insights into BDNF function in depression and anxiety[J]. Nat Neurosci，2007，10（9）：1089-1093.
[13] GREENWOOD B N， STRONG P V， FOLEY T E， et al. Learned helplessness is independent of levels of brain-derived neurotrophic factor in the hippocampus[J]. Neuroscience，2007，144（4）：1193-1120.
（收稿日期：2015-05-10）
（修回日期：2015-06-30；编辑：华强）
