三七活血片质量标准研究
王兆华 纪义波 张大军
摘要：目的 建立三七活血片的质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中的三七、血竭进行鉴别。采用高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量，色谱柱为Shim-pack（岛津）C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8，V/V），检测波长为230 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min。结果 三七、血竭的薄层色谱特征斑点分离清晰，阴性无干扰。芍药苷在0.269 6～1.348 μg范围内线性关系良好（r=0.999 8）；供试品溶液在24 h内稳定，平均加样回收率为98.68%，RSD=0.78%（n=6）。结论 本研究所建立的方法简单、准确可靠、重复性好，可用于控制三七活血片的质量。
关键词：三七活血片；质量标准；三七；血竭；薄层色谱法；高效液相色谱法；芍药苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0087-03
Sduty on Quality Sdandard for Sanqi Huoxue Tablets WANG Zhao-hua1， JI Yi-bo2， ZHANG Da-jun1 （1. Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province， Changchun 130012， China； 2. Jilin Medical Device Testing Institute， Changchun 130062， China）
Abstract： Objective To establish the quality standard for Sanqi Huoxue Tablets. Methods Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets were identified by TLC qualitatively； The content of paeoniflorin in Paeoniae Radix Rubra was determined by HPLC. The separation was performed on Shim-pack-C18 column （150 mm×4.6 mm， 5 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3% phosphoric acid （15.2：84.8， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm， and the column temperature was 30 ℃. Results Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets could be identified by TLC and separated well. Paeoniflorin was in a good linear relationship between 0.269 6–1.348 μg， with a correlation coefficient of 0.999 8. Solution was stable within 24 h， and the average recovery of paeoniflorin was 98.68%， RSD=0.78%. Conclusion The established method is simple， accurate and sensitive， and can be applied to the quality control of Sanqi Huoxue Tablets.
Key words： Sanqi Huoxue Tablets； quality standard； Notoginseng Radix et Rhizoma； Draconis Sanguis； TLC； HPLC； paeoniflorin
三七活血片是在吉林省中医院院内制剂三七活血胶囊基础上确定的实验方剂，由三七、赤芍、血竭、骨碎补等7味中药组成，具有活血止血、散瘀止痛等作用，用于急性软组织损伤等症临床疗效显著，药理
基金项目：吉林省科技发展计划项目（20130727005YY）；长春市科技计划项目（14KG067）
实验表明该制剂在减轻损伤组织，促进血肿吸收和瘀斑消散等方面作用确切[1]。为有效控制三七活血片的质量，保证用药安全有效，本研究建立三七活血片的质量控制方法。采用薄层色谱法，以三七的主要功效成分人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1为对照，对方中三七进行定性鉴别。为增加方法的专属性及信息的全面性，以血竭特征性成分血竭素高氯酸盐及血竭对
照药材为对照，对方中血竭进行定性鉴别。处方中赤芍用量最大且为主要药味，故采用高效液相色谱法（HPLC）对其镇痛抗炎的有效成分芍药苷进行含量测定，并进行方法学验证。
1 仪器与试药
LC-10 AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-10A紫外检测器（日本岛津公司），KQ-250型超声波处理器（天津奥特赛恩斯仪器公司），AE163电子天平（瑞士梅特勒公司）。
人参皂苷Rg1对照品（批号110703-201128，供含量测定用）、三七皂苷R1对照品（批号110745- 201318供含量测定用）、人参皂苷Rb1对照品（批号110704-201223，供含量测定用）、血竭素高氯酸盐对照品（批号110811-201105，供含量测定用）、血竭对照药材（批号906-9905）、芍药苷对照品（批号110736- 201337，供含量测定用），中国食品药品检定研究院。3批三七活血片（批号20140601、20140602、20140603，0.5 g/片）及阴性对照品，吉林省中医药科学院制剂室自制。硅胶G板（手铺，青岛海洋化工有限公司），水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 三七 取三七活血片3片，研细，加甲醇30 mL，超声处理（功率500 W，频率20 kHz）20 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水15 mL微热使溶解，加乙醚振摇提取3次，每次20 mL，弃去乙醚液，水液继用水饱和正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，再用正丁醇饱合氨试液洗涤2次，每次15 mL，弃去碱液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取去掉三七的其他药材，按三七活血片制备工艺操作，制成不含三七的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制备不含三七的阴性对照溶液。另取人参皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1对照品，分别加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，吸取上述5种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，其Rf值适宜，显色清晰，阴性对照无干扰，专属性较好。
2.1.2 血竭 取三七活血片2片，研细，加乙醚10 mL，超声处理（功率500W，频率20 kHz）5 min，过滤，滤液作为供试品溶液。取除血竭的其他药材，按三七活血片制备工艺制成不含血竭的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制备不含血竭的阴性对照溶液。另取血竭对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。再取血竭素高氯酸盐对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，吸取上述4种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干[2-3]。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其Rf值适宜，显色清晰，阴性对照无干扰，专属性较好。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 Shim-pack（岛津）C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8），流速1 mL/min，检测波长230 nm，柱温30 ℃[4]。理论板数按芍药苷峰计算应不低于4000。
2.2.2 对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成67.4 μg/mL的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取三七活血片20片，研细，取粉末0.25 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理（功率500 W，频率20 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例制备不含赤芍的阴性样品，再按“2.2.3”项下方法制备，即得。
2.2.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入色谱仪测定。结果供试品溶液中待测成分色谱峰与芍药苷对照品色谱峰保留时间一致，并且与杂质峰可达到良好的分离，阴性对照溶液无干扰，表明本方法专属性良好。色谱图见图1。
2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液（67.4 μg/mL）4、8、12、16、20 μL，分别注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程。Y=662 679.976X-2903.064，r=0.999 8，表明芍药苷进样量在0.269 6～1.348 μg范围内，进样量与峰面积成良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验 准确吸取芍药苷对照品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样6次，结果芍药苷的峰面积RSD=0.63%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 精密吸取三七活血片（批号20140601）供试品溶液10 μL，每隔3 h进样1次，连续考察24 h，结果芍药苷峰面积RSD=0.68%，表明供试品溶液中指标性成分在24 h内稳定。
2.2.9 重复性试验 按“2.2.3”项下方法，对同一批号三七活血片（批号20140601），平行制备6份供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。芍药苷平均含量为12.13 mg/g，RSD=1.44%，表明该方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知芍药苷含量的同一批三七活血片样品（批号20140601）6份，每份约0.12 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.756 2 mg/mL的芍药苷对照品2 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表1。
3 讨论
制备三七薄层鉴别的供试品溶液时，本研究考察了氨试液、0.5%氢氧化钠溶液及1%氢氧化钠溶液洗涤效果，均可达到较好分离效果，而以氨试液洗涤操作更简便，不需再用水洗涤。笔者曾尝试对方中的骨碎补进行定性鉴别，以柚皮苷对照品为对照，试验了多种鉴别方法，但未能消除阴性对照中的干扰。
另外，曾尝试用HPLC对方中三七所含有效成分人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的总量进行测定，因供试品色谱中待测成分未得到较好分离，测定结果重复性不好，未采用。
对赤芍有效成分芍药苷进行含量测定，本试验参考文献[5-6]，对供试品溶液的制备方法进行了考察。分别考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇的提取效果，结果以甲醇提取效果最好；通过比较超声提取法和加热回流提取法，发现超声提取效果较好且操作更简单；分别考察了乙腈-0.3%磷酸水溶液（12.7∶87.3）、乙腈-0.3%磷酸水溶液（16∶84）、乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8）作为流动相对样品分离效果的影响，结果以乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8）为流动相得到的分离效果最佳，峰形对称，保留时间短且阴性对照无干扰。在测定时还发现芍药苷保留时间不宜过长，否则易产生拖尾。
参考文献：
[1] 陈文学，于德伟.三七活血片抗软组织损伤、镇痛与抗炎药理作用研究[J].中国药房，2015，26（9）：3482.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：147.
[3] 高燕妮，高武翔.跌打七厘片的鉴别及含量测定方法改进[J].中国医药导报，2012，33（9）：117.
[4] 葛美厅，胡双丰.血竭与龙血竭的定性鉴别[J].中国药事，2010， 19（22）：85.
[5] 高颖，房德敏.苏氏接骨胶囊中骨碎补和菟丝子的质量控制[J].中国医院药学杂志，2010，30（4）：333.
[6] 王建，刘金花.反相高效液相色谱法测定胃灵颗粒中芍药苷含量[J].中国药业，2015，24（1）：45.
（收稿日期：2015-03-17）
（修回日期：2015-04-09；编辑：陈静）
摘要：目的 建立三七活血片的质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中的三七、血竭进行鉴别。采用高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量，色谱柱为Shim-pack（岛津）C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8，V/V），检测波长为230 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min。结果 三七、血竭的薄层色谱特征斑点分离清晰，阴性无干扰。芍药苷在0.269 6～1.348 μg范围内线性关系良好（r=0.999 8）；供试品溶液在24 h内稳定，平均加样回收率为98.68%，RSD=0.78%（n=6）。结论 本研究所建立的方法简单、准确可靠、重复性好，可用于控制三七活血片的质量。
关键词：三七活血片；质量标准；三七；血竭；薄层色谱法；高效液相色谱法；芍药苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0087-03
Sduty on Quality Sdandard for Sanqi Huoxue Tablets WANG Zhao-hua1， JI Yi-bo2， ZHANG Da-jun1 （1. Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province， Changchun 130012， China； 2. Jilin Medical Device Testing Institute， Changchun 130062， China）
Abstract： Objective To establish the quality standard for Sanqi Huoxue Tablets. Methods Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets were identified by TLC qualitatively； The content of paeoniflorin in Paeoniae Radix Rubra was determined by HPLC. The separation was performed on Shim-pack-C18 column （150 mm×4.6 mm， 5 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3% phosphoric acid （15.2：84.8， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm， and the column temperature was 30 ℃. Results Notoginseng Radix et Rhizoma and Draconis Sanguis in Sanqi Huoxue Tablets could be identified by TLC and separated well. Paeoniflorin was in a good linear relationship between 0.269 6–1.348 μg， with a correlation coefficient of 0.999 8. Solution was stable within 24 h， and the average recovery of paeoniflorin was 98.68%， RSD=0.78%. Conclusion The established method is simple， accurate and sensitive， and can be applied to the quality control of Sanqi Huoxue Tablets.
Key words： Sanqi Huoxue Tablets； quality standard； Notoginseng Radix et Rhizoma； Draconis Sanguis； TLC； HPLC； paeoniflorin
三七活血片是在吉林省中医院院内制剂三七活血胶囊基础上确定的实验方剂，由三七、赤芍、血竭、骨碎补等7味中药组成，具有活血止血、散瘀止痛等作用，用于急性软组织损伤等症临床疗效显著，药理
基金项目：吉林省科技发展计划项目（20130727005YY）；长春市科技计划项目（14KG067）
实验表明该制剂在减轻损伤组织，促进血肿吸收和瘀斑消散等方面作用确切[1]。为有效控制三七活血片的质量，保证用药安全有效，本研究建立三七活血片的质量控制方法。采用薄层色谱法，以三七的主要功效成分人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1为对照，对方中三七进行定性鉴别。为增加方法的专属性及信息的全面性，以血竭特征性成分血竭素高氯酸盐及血竭对
照药材为对照，对方中血竭进行定性鉴别。处方中赤芍用量最大且为主要药味，故采用高效液相色谱法（HPLC）对其镇痛抗炎的有效成分芍药苷进行含量测定，并进行方法学验证。
1 仪器与试药
LC-10 AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-10A紫外检测器（日本岛津公司），KQ-250型超声波处理器（天津奥特赛恩斯仪器公司），AE163电子天平（瑞士梅特勒公司）。
人参皂苷Rg1对照品（批号110703-201128，供含量测定用）、三七皂苷R1对照品（批号110745- 201318供含量测定用）、人参皂苷Rb1对照品（批号110704-201223，供含量测定用）、血竭素高氯酸盐对照品（批号110811-201105，供含量测定用）、血竭对照药材（批号906-9905）、芍药苷对照品（批号110736- 201337，供含量测定用），中国食品药品检定研究院。3批三七活血片（批号20140601、20140602、20140603，0.5 g/片）及阴性对照品，吉林省中医药科学院制剂室自制。硅胶G板（手铺，青岛海洋化工有限公司），水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 三七 取三七活血片3片，研细，加甲醇30 mL，超声处理（功率500 W，频率20 kHz）20 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水15 mL微热使溶解，加乙醚振摇提取3次，每次20 mL，弃去乙醚液，水液继用水饱和正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，再用正丁醇饱合氨试液洗涤2次，每次15 mL，弃去碱液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取去掉三七的其他药材，按三七活血片制备工艺操作，制成不含三七的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制备不含三七的阴性对照溶液。另取人参皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1对照品，分别加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，吸取上述5种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，其Rf值适宜，显色清晰，阴性对照无干扰，专属性较好。
2.1.2 血竭 取三七活血片2片，研细，加乙醚10 mL，超声处理（功率500W，频率20 kHz）5 min，过滤，滤液作为供试品溶液。取除血竭的其他药材，按三七活血片制备工艺制成不含血竭的阴性样品，按供试品溶液制备方法，制备不含血竭的阴性对照溶液。另取血竭对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。再取血竭素高氯酸盐对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B]试验，吸取上述4种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干[2-3]。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其Rf值适宜，显色清晰，阴性对照无干扰，专属性较好。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 Shim-pack（岛津）C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8），流速1 mL/min，检测波长230 nm，柱温30 ℃[4]。理论板数按芍药苷峰计算应不低于4000。
2.2.2 对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成67.4 μg/mL的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取三七活血片20片，研细，取粉末0.25 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理（功率500 W，频率20 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例制备不含赤芍的阴性样品，再按“2.2.3”项下方法制备，即得。
2.2.5 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入色谱仪测定。结果供试品溶液中待测成分色谱峰与芍药苷对照品色谱峰保留时间一致，并且与杂质峰可达到良好的分离，阴性对照溶液无干扰，表明本方法专属性良好。色谱图见图1。
2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液（67.4 μg/mL）4、8、12、16、20 μL，分别注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程。Y=662 679.976X-2903.064，r=0.999 8，表明芍药苷进样量在0.269 6～1.348 μg范围内，进样量与峰面积成良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验 准确吸取芍药苷对照品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样6次，结果芍药苷的峰面积RSD=0.63%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 精密吸取三七活血片（批号20140601）供试品溶液10 μL，每隔3 h进样1次，连续考察24 h，结果芍药苷峰面积RSD=0.68%，表明供试品溶液中指标性成分在24 h内稳定。
2.2.9 重复性试验 按“2.2.3”项下方法，对同一批号三七活血片（批号20140601），平行制备6份供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。芍药苷平均含量为12.13 mg/g，RSD=1.44%，表明该方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知芍药苷含量的同一批三七活血片样品（批号20140601）6份，每份约0.12 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.756 2 mg/mL的芍药苷对照品2 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表1。
3 讨论
制备三七薄层鉴别的供试品溶液时，本研究考察了氨试液、0.5%氢氧化钠溶液及1%氢氧化钠溶液洗涤效果，均可达到较好分离效果，而以氨试液洗涤操作更简便，不需再用水洗涤。笔者曾尝试对方中的骨碎补进行定性鉴别，以柚皮苷对照品为对照，试验了多种鉴别方法，但未能消除阴性对照中的干扰。
另外，曾尝试用HPLC对方中三七所含有效成分人参皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的总量进行测定，因供试品色谱中待测成分未得到较好分离，测定结果重复性不好，未采用。
对赤芍有效成分芍药苷进行含量测定，本试验参考文献[5-6]，对供试品溶液的制备方法进行了考察。分别考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇的提取效果，结果以甲醇提取效果最好；通过比较超声提取法和加热回流提取法，发现超声提取效果较好且操作更简单；分别考察了乙腈-0.3%磷酸水溶液（12.7∶87.3）、乙腈-0.3%磷酸水溶液（16∶84）、乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8）作为流动相对样品分离效果的影响，结果以乙腈-0.3%磷酸水溶液（15.2∶84.8）为流动相得到的分离效果最佳，峰形对称，保留时间短且阴性对照无干扰。在测定时还发现芍药苷保留时间不宜过长，否则易产生拖尾。
参考文献：
[1] 陈文学，于德伟.三七活血片抗软组织损伤、镇痛与抗炎药理作用研究[J].中国药房，2015，26（9）：3482.
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[4] 葛美厅，胡双丰.血竭与龙血竭的定性鉴别[J].中国药事，2010， 19（22）：85.
[5] 高颖，房德敏.苏氏接骨胶囊中骨碎补和菟丝子的质量控制[J].中国医院药学杂志，2010，30（4）：333.
[6] 王建，刘金花.反相高效液相色谱法测定胃灵颗粒中芍药苷含量[J].中国药业，2015，24（1）：45.
（收稿日期：2015-03-17）
（修回日期：2015-04-09；编辑：陈静）
