RP—HPLC同时测定益气固本颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和藁本内酯的含量
张小华 沈涛 梁海宁 李季文 毕映燕
摘要：目的 建立反相高效液相色谱法测定益气固本颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和藁本内酯含量的方法。方法 采用Waters SymmetryShield C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%甲酸梯度洗脱溶液，检测波长为260 nm。结果 毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性范围为0.162～0.810 μg（r=0.999 6），加样回收率为99.64%（RSD=1.94%）。藁本内酯的线性范围为0.386～1.930 μg（r=0.999 8），加样回收率为98.56%（RSD=1.60%）。结论 该方法可为益气固本颗粒质量标准的完善提供依据。
关键词：益气固本颗粒；反相高效液相色谱法；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；藁本内酯
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.022
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0079-03
Simultaneous Determination of Calycosin-7-glycoside and Ligustilide in Yiqi Guben Particles by RP-HPLC ZHANG Xiao-hua， SHEN Tao， LIANG Hai-ning， LI Ji-wen， BI Ying-yan （Pharmacy Department， Gansu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China）
Abstract： Objective To develop a RP-HPLC method for determining the contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide in Yiqi Guben Particles. Methods The contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide were determined with a Waters SymmetryShield C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile-0.2% formic acid with gradient elution. The detection wavelength was 260 nm. Results The linear range of calycosin-7-glycoside was within 0.162–0.810 μg （r=0.999 6）， and the recovery rate was 99.64% （RSD=1.94%）. The linear range of ligustilide was within 0.386–1.930 μg （r=0.999 8）， and the recovery rate was 98.56% （RSD=1.60%）. Conclusion This method can provide experimental basis for quality control of Yiqi Guben Particles.
Key words： Yiqi Guben Particles； RP-HPLC； calycosin-7-glycosidase； ligustilide
益气固本颗粒是由本院展锐主任医师临床经验方研制而成的颗粒剂，全方由黄芪、白术、防风、当归等8味中药组成，具有益气固本、温肾健脾、扶正祛邪功效，通过调节肿瘤患者免疫功能，扶正抗癌，从而提高患者生存质量，延长生存期。黄芪具有补气升阳、固表止汗、生津养血等功效，为方中主药。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是2010年版《中华人民共和国药典》[1]规定的黄芪质量控制的特征指标。藁本内酯是当归抗肿瘤、镇痛消炎的主要成分，在其挥发油中含量最高[2-3]。对处方中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯进行准确定量，是该制剂质量控制的关键步骤。本试验建立同时测定益气固本颗粒中毛蕊异黄酮葡萄
基金项目：甘肃省科技支撑计划（1304FKCA105）
糖苷及藁本内酯的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法，为其质量标准的拟定提供依据。
1 仪器与试药
Waters HPLC系统，包括Waters 1525二元泵（美国Waters公司），Waters 2487双波长紫外检测器（美国Waters公司），Bree色谱工作站；HS6150型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；METTLER AE240电子分析天平（赛多利斯公司）；RE52CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
益气固本颗粒（甘肃省中医院，批号20140319、20140514、20141106），毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（天津一方科技有限公司，批号AB019C-a，纯度≥99%），藁本内酯对照品（天津一方科技有限公司，批号AB086L，纯度≥99%），乙腈为色谱纯（天津市光复精细化工研究所），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters SymmetryShield C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：室温；进样量：10 μL[4-6]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品0.81 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为81 ?g/mL的对照品储备液A液。精密称取藁本内酯对照品38.53 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为193 ?g/mL的对照品储备液B液。将上述对照品储备液A液和B液按1∶1比例混合均匀，经0.45 ?m滤膜过滤，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取益气固本颗粒约1 g，精密称定，研细，置具塞锥形瓶中，加甲醇定容至10 mL，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）20 min，放冷，摇匀，经0.45 ?m滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按益气固本颗粒的处方及制备方法，制备不含黄芪、当归的颗粒，作为阴性样品。取阴性样品约1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备，即得。
2.5 系统适用性试验
按“2.1”项下色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液进样测定，毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯的保留时间分别为19.8、28.5 min，分离度均>1.5。结果表明，样品中其他成分对毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯的测定无干扰。色谱图见图1。
2.6 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下对照品储备液A液和B液适量，用甲醇稀释成毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度分别为16.25、32.4、48.62、64.9、81 ?g/mL，藁本内酯浓度分别为38.6、77.2、115.8、154.4、193 ?g/mL的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样测定，记录峰面积，以峰面积对进样浓度进行回归分析，得回归方程。毛蕊异黄酮葡萄糖苷Y=153 636X+3853.7（r=0.999 6），线性范围为0.162～0.810 μg；藁本内酯Y=2.153×106X+0.1833（r=0.999 8），线性范围为0.386～1.930 μg。
2.7 精密度试验
精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，分别测其峰面积，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯的峰面积RSD分别为0.43%、1.22%，表明仪器精密度较好。
2.8 重复性试验
称取同一批号益气固本颗粒（批号20140514）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按含量测定方法进行测定。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯浓度分别为0.21、0.89 mg/g，RSD分别为0.42%、0.77%，表明本方法重复性良好。
2.9 稳定性试验
精密吸取同一批号益气固本颗粒（批号20140514），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别在放置0、2、4、6、12、24 h进样，测定峰面积，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯峰面积的RSD分别为1.31%、1.20%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.10 加样回收率试验
精密称取已知含量的益气固本颗粒（批号20140514）约1 g，平行6份，分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，计算回收率，结果见表2。
2.11 样品含量测定
取3个批次供试品，每批平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，测定峰面积，以外标法计算样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯含量，结果见表3。
3 讨论
供试品溶液的制备比较了甲醇、70%甲醇、50%甲醇及乙醇为提取溶剂[7]，结果显示，使用甲醇提取有效成分时，毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯提取较为完全，且杂质峰较少，主峰分离度好。同时，比较了超声20 min及超声40 min，结果表明，提取时间太长则藁本内酯含量减少较明显，故选择甲醇超声提取20 min的方法进行供试品溶液的制备。
检测波长的选择，文献报道毛蕊异黄酮葡萄糖苷最大吸收波长为260 nm[8]，藁本内酯多在320 nm进行含量测定[9]。本研究测定过程中发现，260 nm波长下毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯吸收度值均较高，而在320 nm波长下毛蕊异黄酮葡萄糖苷几乎无吸收度值，故选择在260 nm波长下进行2个成分的同时测定。
本试验曾采用乙腈-0.2%甲酸溶液（30∶70）等度洗脱方法进行检测，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷分离度不好，且藁本内酯出峰时间较长。随后采用乙腈- 0.2%甲酸溶液梯度洗脱的方法，得到的色谱峰峰型和分离度较好，同时缩短了检测时间，提高了检验效率。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：284.
[2] 路新华，梁鸿，赵玉英.当归中藁本内酯类化合物的分离与结构鉴定[J].中国中药杂志，2003，28（5）：423-425.
[3] 任鹏飞，邓毅.当归及其有效成分药效学研究进展[J].西部中医药， 2012，25（9）：125-127.
[4] 姚雪莲，裴彩云，王宗权.不同产地、不同采收期黄芪药材及饮片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素含量测定[J].药物分析杂志，2012，32（5）：797.
[5] 郎永英，谈瑄忠，陆兔林.RP-HPLC法同时测定复方芪归益气颗粒中5种成分[J].中成药，2013，35（12）：2654-2657.
[6] 马艳蓉，柴国林，张莅峡.HPLC-ELSD在中药分析中的应用[J].中国中医药信息杂志，2004，11（4）：368-371.
[7] 张小华，胡君茹，马琴国，等.双波长HPLC同时测定安坤种子丸中阿魏酸和芍药苷含量[J].中国中医药信息杂志，2013，20（9）：55-57.
[8] 李圆圆，宋英孙，方芳.HPLC测定益心通脉合剂中丹参素钠和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（22）：64-67.
[9] 曹建敏，王宗花，丁明玉.反相高效液相色谱法同时测定川芎中的四种内酯类化合物[J].色谱，2005，23（5）：531-533.
（收稿日期：2015-01-19）
（修回日期：2015-01-29；编辑：陈静）
摘要：目的 建立反相高效液相色谱法测定益气固本颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和藁本内酯含量的方法。方法 采用Waters SymmetryShield C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%甲酸梯度洗脱溶液，检测波长为260 nm。结果 毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性范围为0.162～0.810 μg（r=0.999 6），加样回收率为99.64%（RSD=1.94%）。藁本内酯的线性范围为0.386～1.930 μg（r=0.999 8），加样回收率为98.56%（RSD=1.60%）。结论 该方法可为益气固本颗粒质量标准的完善提供依据。
关键词：益气固本颗粒；反相高效液相色谱法；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；藁本内酯
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.022
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0079-03
Simultaneous Determination of Calycosin-7-glycoside and Ligustilide in Yiqi Guben Particles by RP-HPLC ZHANG Xiao-hua， SHEN Tao， LIANG Hai-ning， LI Ji-wen， BI Ying-yan （Pharmacy Department， Gansu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China）
Abstract： Objective To develop a RP-HPLC method for determining the contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide in Yiqi Guben Particles. Methods The contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide were determined with a Waters SymmetryShield C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile-0.2% formic acid with gradient elution. The detection wavelength was 260 nm. Results The linear range of calycosin-7-glycoside was within 0.162–0.810 μg （r=0.999 6）， and the recovery rate was 99.64% （RSD=1.94%）. The linear range of ligustilide was within 0.386–1.930 μg （r=0.999 8）， and the recovery rate was 98.56% （RSD=1.60%）. Conclusion This method can provide experimental basis for quality control of Yiqi Guben Particles.
Key words： Yiqi Guben Particles； RP-HPLC； calycosin-7-glycosidase； ligustilide
益气固本颗粒是由本院展锐主任医师临床经验方研制而成的颗粒剂，全方由黄芪、白术、防风、当归等8味中药组成，具有益气固本、温肾健脾、扶正祛邪功效，通过调节肿瘤患者免疫功能，扶正抗癌，从而提高患者生存质量，延长生存期。黄芪具有补气升阳、固表止汗、生津养血等功效，为方中主药。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是2010年版《中华人民共和国药典》[1]规定的黄芪质量控制的特征指标。藁本内酯是当归抗肿瘤、镇痛消炎的主要成分，在其挥发油中含量最高[2-3]。对处方中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯进行准确定量，是该制剂质量控制的关键步骤。本试验建立同时测定益气固本颗粒中毛蕊异黄酮葡萄
基金项目：甘肃省科技支撑计划（1304FKCA105）
糖苷及藁本内酯的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法，为其质量标准的拟定提供依据。
1 仪器与试药
Waters HPLC系统，包括Waters 1525二元泵（美国Waters公司），Waters 2487双波长紫外检测器（美国Waters公司），Bree色谱工作站；HS6150型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；METTLER AE240电子分析天平（赛多利斯公司）；RE52CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
益气固本颗粒（甘肃省中医院，批号20140319、20140514、20141106），毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（天津一方科技有限公司，批号AB019C-a，纯度≥99%），藁本内酯对照品（天津一方科技有限公司，批号AB086L，纯度≥99%），乙腈为色谱纯（天津市光复精细化工研究所），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters SymmetryShield C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：室温；进样量：10 μL[4-6]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品0.81 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为81 ?g/mL的对照品储备液A液。精密称取藁本内酯对照品38.53 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为193 ?g/mL的对照品储备液B液。将上述对照品储备液A液和B液按1∶1比例混合均匀，经0.45 ?m滤膜过滤，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取益气固本颗粒约1 g，精密称定，研细，置具塞锥形瓶中，加甲醇定容至10 mL，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）20 min，放冷，摇匀，经0.45 ?m滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按益气固本颗粒的处方及制备方法，制备不含黄芪、当归的颗粒，作为阴性样品。取阴性样品约1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备，即得。
2.5 系统适用性试验
按“2.1”项下色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液进样测定，毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯的保留时间分别为19.8、28.5 min，分离度均>1.5。结果表明，样品中其他成分对毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯的测定无干扰。色谱图见图1。
2.6 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下对照品储备液A液和B液适量，用甲醇稀释成毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度分别为16.25、32.4、48.62、64.9、81 ?g/mL，藁本内酯浓度分别为38.6、77.2、115.8、154.4、193 ?g/mL的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样测定，记录峰面积，以峰面积对进样浓度进行回归分析，得回归方程。毛蕊异黄酮葡萄糖苷Y=153 636X+3853.7（r=0.999 6），线性范围为0.162～0.810 μg；藁本内酯Y=2.153×106X+0.1833（r=0.999 8），线性范围为0.386～1.930 μg。
2.7 精密度试验
精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，分别测其峰面积，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯的峰面积RSD分别为0.43%、1.22%，表明仪器精密度较好。
2.8 重复性试验
称取同一批号益气固本颗粒（批号20140514）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按含量测定方法进行测定。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯浓度分别为0.21、0.89 mg/g，RSD分别为0.42%、0.77%，表明本方法重复性良好。
2.9 稳定性试验
精密吸取同一批号益气固本颗粒（批号20140514），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别在放置0、2、4、6、12、24 h进样，测定峰面积，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯峰面积的RSD分别为1.31%、1.20%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.10 加样回收率试验
精密称取已知含量的益气固本颗粒（批号20140514）约1 g，平行6份，分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，计算回收率，结果见表2。
2.11 样品含量测定
取3个批次供试品，每批平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，测定峰面积，以外标法计算样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯含量，结果见表3。
3 讨论
供试品溶液的制备比较了甲醇、70%甲醇、50%甲醇及乙醇为提取溶剂[7]，结果显示，使用甲醇提取有效成分时，毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯提取较为完全，且杂质峰较少，主峰分离度好。同时，比较了超声20 min及超声40 min，结果表明，提取时间太长则藁本内酯含量减少较明显，故选择甲醇超声提取20 min的方法进行供试品溶液的制备。
检测波长的选择，文献报道毛蕊异黄酮葡萄糖苷最大吸收波长为260 nm[8]，藁本内酯多在320 nm进行含量测定[9]。本研究测定过程中发现，260 nm波长下毛蕊异黄酮葡萄糖苷及藁本内酯吸收度值均较高，而在320 nm波长下毛蕊异黄酮葡萄糖苷几乎无吸收度值，故选择在260 nm波长下进行2个成分的同时测定。
本试验曾采用乙腈-0.2%甲酸溶液（30∶70）等度洗脱方法进行检测，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷分离度不好，且藁本内酯出峰时间较长。随后采用乙腈- 0.2%甲酸溶液梯度洗脱的方法，得到的色谱峰峰型和分离度较好，同时缩短了检测时间，提高了检验效率。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：284.
[2] 路新华，梁鸿，赵玉英.当归中藁本内酯类化合物的分离与结构鉴定[J].中国中药杂志，2003，28（5）：423-425.
[3] 任鹏飞，邓毅.当归及其有效成分药效学研究进展[J].西部中医药， 2012，25（9）：125-127.
[4] 姚雪莲，裴彩云，王宗权.不同产地、不同采收期黄芪药材及饮片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素含量测定[J].药物分析杂志，2012，32（5）：797.
[5] 郎永英，谈瑄忠，陆兔林.RP-HPLC法同时测定复方芪归益气颗粒中5种成分[J].中成药，2013，35（12）：2654-2657.
[6] 马艳蓉，柴国林，张莅峡.HPLC-ELSD在中药分析中的应用[J].中国中医药信息杂志，2004，11（4）：368-371.
[7] 张小华，胡君茹，马琴国，等.双波长HPLC同时测定安坤种子丸中阿魏酸和芍药苷含量[J].中国中医药信息杂志，2013，20（9）：55-57.
[8] 李圆圆，宋英孙，方芳.HPLC测定益心通脉合剂中丹参素钠和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（22）：64-67.
[9] 曹建敏，王宗花，丁明玉.反相高效液相色谱法同时测定川芎中的四种内酯类化合物[J].色谱，2005，23（5）：531-533.
（收稿日期：2015-01-19）
（修回日期：2015-01-29；编辑：陈静）
