肌肉中硝基呋喃类代谢物测定方法优化

    龚波

    摘要：比较了肌肉中硝基呋喃类代谢物残留量检测的常用方法，并加以改进。

    关键词：肌肉；硝基呋喃类代谢物；检测方法；比较

    中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）12-0007-01

    硝基呋喃类药物是一类人工合成的具有5-硝基结构的广谱抗生素，对革兰氏阳性及阴性菌均有一定抗菌作用。因其价格低廉，效果好，被广泛应用于畜牧养殖中[1]。研究表明，此类药物及其代谢物可使试验动物发生癌变和基因突变，我国已于2002 年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令[2]。硝基呋喃类药物在动物体内代谢速度快，不易被检测到[3]，然而其代谢产物可在相当长时间内留存于可食组织中，因此常通过监测其代谢物的残留来监控硝基呋喃类物的使用情况。

    1 常用方法

    目前，在肌肉中硝基呋喃类代谢物残留量检测中，常用的方法有农业部781号公告-4-2006动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法[4]（以下简称《公告》）。该标准采用依次用甲醇、乙醇和乙醚洗涤，去除杂质。在酸性条件下水解，与2-硝基苯甲醛溶液衍生化反应，调PH值后产物经乙酸乙酯提取，氮气吹干。溶解残余物，用LC-MS测定，同位素内标法定量。

    另一种方法是GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱-串联质谱法[5]（以下简称《国标》）。该标准样品经盐酸水解，邻硝基苯甲醛衍生化反应，调PH值后，产物经乙酸乙酯提取，正己烷净化，氮气吹干。溶解残余物，用LC-MS测定，同位素内标法定量。

    2 方法比较

    2.1 洗涤

    《公告》中样品用甲醇、乙醇和乙醚洗涤6次，步骤繁琐，且经乙醚洗涤后，造成后面步骤中离心管易膨盖，提取液洒出，影响实验结果的准确性。

    《国标》中，样品经过10mL甲醇-水溶液（1+1）洗涤1次后，可直接酸水解衍生，步骤简单，易操作。

    2.2 衍生

    虽然2种方法中加入盐酸的浓度和衍生剂的溶剂均不同，但经试验比较，两者对试验结果并没有十分显著的影响，均具有可操作性。

    2.3 提取

    《公告》方法中的样品经提取吹干后得到清亮的复溶液，经滤膜过滤后即可上机。而《国标》方法中的样品提取吹干后复溶液浑浊，即使按照方法中用乙腈饱和的正己烷去脂2次后，溶液任然较浑浊，不易通过滤膜，上机后对仪器有一定损伤。

    2.4 流动相的选择

    比较两种方法梯度洗脱程序，见表1，表2。《公告》方法流动相配置复杂，

    且峰型不如《国标》的好，但两种程序耗时都较长。笔者以XbridgeC182.1*150mm， 3.5μm为例比较了乙腈- 乙酸铵、甲醇- 乙酸铵两种不同流动相对目标物离子化程度的影响。结果表明，乙腈-0.5 mmol /L 乙酸铵作为流动相时，四种代谢物的衍生物响应较为稳定[6]。在水相中不加入0.1%甲酸，也能得到较好的质谱离子化效率。因此，笔者优化了梯度洗脱程序，方案见表3。

    3 小结

    经过比较，《国标》方法虽然洗涤步骤比较简单，但提取后油脂太多，难以得到清亮的待测液，对仪器有一定损伤，故建议按照《公告》的方法进行前处理。但《公告》方法的流动相及洗脱程序繁琐耗时，建议按照笔者改进的流动相及洗脱程序进行上机分析。这样，既可以保证检测结果的可靠性，也可以提高工作效率。