免疫荧光技术在检测精子中PKA蛋白表达中的应用

    张孝清++曹国弟++孙子龙

    摘要：为了探测精子中蛋白激酶A（PKA）的定位表达，通过饲养8只性成熟昆明雄性小鼠，49天后采集其精子制备精子悬液，涂片。用PKA多克隆抗体与精子进行免疫试验，阴性对照组用PBS取代，然后用FITC标记的羊抗兔二抗进行荧光标记。用荧光显微镜镜检，结果显示精子中PKA蛋白的表达部位主要为精子尾部的主段和中段。

    关键词：免疫荧光技术；小鼠；精子；PKA

    中图分类号：Q492.4 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）12-0005-02

    作为畜牧业大国的中国，家畜的繁殖直接影响到畜牧业的顺利和健康发展。而在家畜繁殖中，精子的质量又是影响家畜繁殖的直接因素，精子蛋白质质量或数量的变化往往是精子的结构或功能异常的表现，因此，对家畜精子的蛋白质组成及变化的全面了解将有助于探讨精子发生、分化及精卵相互识别与结合的生理病理机制。

    蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）作为精子中的一种蛋白激酶，可以通过磷酸化激活多种酶，直接影响精子蛋白的功能，在精子的成熟、运动和受精过程中发挥着重要作用[1]。因此，通过对精子中PKA的研究，有望从蛋白质整体水平了解精子的发生及受精机制。

    目前蛋白质的检测分为定量检测和定位检测。蛋白质的定位检测有免疫荧光技术和免疫组织化学技术。荧光抗体技术又称免疫荧光技术（Immunofluorescence technique），是在免疫学、生物化学和显微镜技术发展的基础上建立起来的一项技术，IFA始创于20世纪40年代初，由Coons等（1941年）首次采用荧光素标记抗体检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原并获得成功。现已广泛应用于多种疾病的诊断与检测。本试验用免疫荧光技术对小鼠精子PKA蛋白的定位表达，为以后进一步研究精子PKA蛋白的功能提供了依据。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂及仪器

    多聚甲醛（AR）、PKA多克隆抗体、BSA、TritonX-100、FITC标记的羊抗兔二抗；生物显微镜、图像分析软件（Image-Proplus v.5.1）、HPS-250生化培养箱。

    1.2 方法

    1.2.1 试验动物 8只性成熟昆明雄性小鼠，体重20 g左右，由山西医科大学实验动物中心提供，均为普通级动物。供试小鼠分笼饲养，饮用去离子水，并饲喂标准饲料，整个试验期间所有小鼠均自由采食和自由饮水的饲养方式。49 d后[（40±2） d为一个精子发生周期]，取出小鼠附睾尾部及输精管，用针头冲出精子，放入1.5 mL EP管中，在二氧化碳培养箱孵育10 min，获取纯净的精子悬液，涂片，进行免疫荧光试验。

    1.2.2 免疫荧光组织化学试验 37 ℃用PBS洗精；添加含4%多聚甲醛的PBS固定（37 ℃，30 min）；用含0.05 mol/L氨基乙酸的PBS洗3次；100 μL精子悬液涂片；用0.2%TritonX-100的PBS浸10 min，后3×3次/minPBS冲洗；3%BSA的PBS封闭（37 ℃，1 h）；用1：100的一抗4 ℃孵育过夜，之后37℃ 2 h（阴性对照不加一抗，用PBS取代）；用4 ℃的PBS清洗3次，每次5 min，吹干；1：200的二抗（FITC标记的羊抗兔二抗溶于1%BSA-PBS）37 ℃ 1 h；PBS洗3次，3～5 min/次，多余的滤液吹干；封片（缓冲甘油封片剂）；最后用荧光显微镜镜检。

    2 结果与分析

    阴性对照组在普通光学显微镜明场下结果见图1，荧光显微镜下结果见图2；试验组在普通光学显微镜明场下结果见图3，荧光显微镜下如图4。图5为图3和图4的合成图。

    结果显示精子中PKA蛋白的表达部位为精子尾部的主段和中段。

    3 讨论

    3.1 PKA蛋白的生物功能及在精子中的作用

    PKA全酶包括4个亚基 （R2C2），两个相同的调节亚基（R）和两个相同的催化亚基（C），R亚基有两个cAMP结合位点，具有调节功能。在细胞内cAMP是重要的第二信使物质，在细胞的跨膜信息转导中起着信号放大和调节细胞功能的重要作用。PKA是第二信使的直接靶酶，通过磷酸化或去磷酸化作用[2]，控制信号转导途径中其他酶类或蛋白质的活性，介导cAMP的信号转导，PKA为依赖cAMP的蛋白激酶，主要作用是传递细胞激外刺激信号、影响膜蛋白的磷酸化而改变细胞膜的通透性，调节细胞的增殖、分化和凋亡等，它们均是通过使各自的底物磷酸化来调节细胞的代谢、生长和增殖。

    cAMP/PKA 信号通路：cAMP/PKA 这条信号通路通常被认为是调节哺乳动物精子运动的一条极为重要的途径[3]。在哺乳动物精子获能过程中，这条信号通路还被认为是胞内信号传递的主要通路。胞外刺激信号与精子表面受体结合后，通过GTP结合蛋白（G蛋白）传递给腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase，AC）使其活化。维持精子活力重要的过程是激活PKA后催化精子鞭毛蛋白磷酸化。通过cAMP/PKA 和钙离子信号通路的共同作用，可使精子胞体内cAMP 水平迅速上升，从而上调精子鞭毛发生剧烈的波动，导致精子超激活运动[4]。

    3.2 精子中PKA蛋白的表达

    PKA蛋白的表达在精子各部都有，可以推测PKA蛋白参与精子大多数生理活动（如精子的成熟、运动和顶体反应等），说明PKA蛋白在精子活动中起着非常重要的作用，影响着精子的活力。

    4 小结

    免疫荧光技术以其高特异性、高灵敏度等优点用于蛋白质的检测。本试验用荧光显微镜镜检，结果显示精子中PKA蛋白的表达部位主要为精子尾部的主段和中段。

    参考文献：

    [1] 李 扬.蛋白激酶A对精子顶体反应和活力的影响[J].中国男科学杂志，2002（1）：63-65.

    [2] 周思畅，等.获能期间精子蛋白的酪氨酸磷酸化[J].生命科学，2006，18（3）：285-289.

    [3] 李 扬.环磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信号传导通路对精子运动功能调节机制的研究[D].武汉：华中科技大学，2005.

    [4] 李 杨，刘继红.双丁酰环磷酸腺苷对人精子运动功能的影响[J] .中华男科学，2002，8（6）：398-400.