鸡马立克氏病的诊断

    石丽娟

    摘要：鸡马立克氏病是由疱疹病毒引起的鸡的一种淋巴细胞增生性、高度接触性传染病。利用解剖学、组织学、血清学和病毒学检查对疑似鸡马立克氏病进行了诊断。

    关键词：鸡马立克氏病；诊断；防治

    中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）12-0014-03

    马立克氏病（Mareks disease，MD）是由马立克氏病疱疹病毒引起的传染性肿瘤性疾病，是最常见的一种鸡淋巴组织增生性传染病[1]。以外周神经包括虹膜、皮肤在内的各种器官和组织的单核性细胞浸润为特征[2]。马立克氏病对1日龄雏鸡最易感染，2～18周龄鸡均可发病。母鸡比公鸡易感性高。潜伏期常为3～4周，一般在50日龄以后出现症状，70日龄后陆续出现死亡，90日龄以后达到高峰，偶见3～4周龄的幼龄鸡和60周龄的老龄鸡发病。该病的发病率变化很大，一般肉鸡为20%～30%，个别达60%；产蛋鸡为10%～15%，严重达50%，死亡率与之相当。MD 存在于世界上所有养禽国家和地区，随着养鸡业的集约化程度的提高，其危害增大，受害鸡群的损失可高达50%以上。

    1 材料与方法

    1.1 试验材料

    1.1.1 病料 丹东市某地区某农户送检的病死鸡30只，雏鸡20只。

    1.1.2 试剂 MD阳性血清、MD沉淀抗原、甲醛、乙醇（95%）、二甲苯、石蜡、甘油、苏木素、钾明矾、曙红、NACL。

    （1）阳性血清的制备：用已知的标准MD抗原与鸡群中慢性病鸡或康复鸡的血清做琼脂凝胶试验，如出现清晰的沉淀线，则为MD阳性血清。采血分离血清加0.01%硫柳汞防腐，冻结保存备用。

    （2）琼脂平板制备：用含8%NaCL的硝酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）配制1%琼脂糖，水浴加热使琼脂糖充分溶解，多层纱布过滤，将无菌平皿（直径9 cm）置水平台上，每个平皿倒入融化的琼脂糖约15～20 mL[13]。使其厚度为2.5～3.0 mm。注意倾倒时勿产生气泡，置4 ℃冰箱中保存备用。

    在已制备的琼脂板上，用打孔器按六角形图案打孔，或用梅花形打孔器。中央打1个孔，孔径4 mm，周围打6个孔，孔径3 mm，中央孔与周围孔孔距为3 mm。将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向挑出，勿损坏孔的边缘，避免琼脂层脱离平皿底部[14]。将平皿底部置80～90 ℃水浴中旋转数秒钟，或放在酒精灯火焰上缓缓加热，微微烫即可。使孔底边缘的琼脂少许熔化以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。

    1.1.3 仪器 显微镜、电热恒温培养箱（DHG-9053A型）、切片机、水浴锅、座式自动电热压力蒸汽灭菌器、微量移液器、电炉、平皿、架盘药物天平、砝码、药匙、量筒、烧杯、玻璃棒、纱布、漏斗、毛刷、剪子、手术刀、镊子、载玻片、盖玻片、木块、废液缸、酒精灯、滤纸、树胶、新鲜蛋白、1 mL注射器、三分试管、加样器、加样滴头、打孔器、琼脂扩散平板等。

    1.2 试验方法

    1.2.1 病死鸡剖检 将送检的病例进行尸体剖检，外部检查之后用清水将禽体羽毛浸湿，切开大腿与腹侧连接的皮肤，用力将两大腿向外翻压直到两髋关节脱臼，使禽体背卧位平躺。在泄殖孔前的皮肤作一条横切线，由此切线中部沿腹中线由后向前剪开皮肤，直到喙角，使腹部和胸部皮肤分离，进行临床剖检诊断。在临床症状观察、尸体剖检的基础上，从待检鸡的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓丰富的羽毛供实验室检验，以寻求确诊。

    1.2.2 病理组织切片

    （1）切片制备。固定：用福尔马林固定24 h。浸洗：用自来水冲洗组织块24 h。脱水：洗涤后组织块在70%、80%、90%、95%、100%（A），100%（B）乙醇中每级各停留2 h。透明：把组织块放到二甲苯中至透明。浸蜡与包埋：将已透明的材料放入石蜡中，使材料中充满石蜡；将包埋用的石蜡倒入小瓷槽内，用镊子将浸过石蜡的材料放入倒有石蜡的小瓷槽内，当表面冷却后，将小瓷槽轻快地放入冷水中，使蜡块浮起后，即可收取，待切。切片：首先将包埋于同一蜡块中的材料分开，使每一小蜡块中只含有一块材料；然后，将蜡块修成四方形或长方形，并粘在木块上；这时将蜡块固定在切片机上进行切片，厚度在5 μm之间。展片与贴片：首先将蜡带斩为单片，再将单个蜡片放于40 ℃的温水中，使其展开，展平，再取一张中央涂有甘油-蛋白胶的载片伸入温水中，将蜡片捞于载片中央，倾去多余的水份后置于干燥箱中，60 ℃条件下烘干。染色、脱水、透明：把浸于70%乙醇的组织块加入倍量蒸馏水，两次稀释至蒸馏水约2 h，投入碘酸钠苏木精，蒸馏水分色10 h，自来水蓝化3 d，蒸馏水洗1 min，70%、80%、90%乙醇逐级脱水各1 h，伊红溶液染色2 d，90%乙醇（A）、（B）脱水与分色各1 h，100%乙醇（A）、（B）各脱水1 h，二甲苯（A）、（B）透明各1 h。封存：将已经透明的切片从二甲苯（B）中取出，滴加树胶，盖上盖玻片即可，拷干后制成永久性标本。

    （2）注意事项。组织固定：用于组织固定的材料必须新鲜，采集和分割后要立刻固定，不得延误；固定材料体积的大小，以不超过直径5 mm为准，材料与固定液的比例，以1：20为准；所用固定液以新配的为好，并放置在阴凉处，不要在日光下直晒；材料固定完毕后，必须在容器外贴上标签，以防止相互混淆。组织脱水：组织脱水是在低浓度乙醇中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体；在高浓度乙醇中，每级停留时间也不宜太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片；脱水应彻底干净，否则与二甲苯混合后，将呈乳白色浑浊，虽然可以倒回重脱，但效果不好；如需过夜，应停留在70%乙醇中。组织块透明：组织块透明时要注意二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封藏，手续要敏捷，不宜久置，否则待二甲苯挥发干净后，组织就会变硬发白，即使再加树胶封藏，由于树胶不能浸入组织，封后也无用处；二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水气侵入，出现白色云雾状；二甲苯必须保持无水无酸。若用1～2滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已含有水分，不能再用。石蜡切片制作：检验过程中，石蜡切片制作出现了材料裂隙、破碎的情况，请做类似试验时借鉴。

    通过流行病学、临床症状、剖检变化、组织学观察可以作出诊断，进一步确诊还需进行琼脂扩散沉淀实验、病毒分离等方法。

    1.2.3 血清学诊断（琼脂扩散试验）

    （1）用MD抗原检测被检鸡血清样本，用滴管在中央孔加入MD抗原，标准阳性血清分别加入外周1、4孔。被检鸡血清按顺序分别加入4个外周孔中，每一个被检样用1个滴头。加样完毕，盖上平皿，做好标记、编号，放入带盖湿盒中，置37 ℃温箱内24～48 h，观察并做详细记录。

    （2）用MD阳性血清检测鸡的羽髓，选拔被检鸡含羽髓的翅羽或身体其他部位的大羽（或新生羽）数根，将含有羽髓的羽根按鸡的编号分别集于三分管内，每管加2～3滴蒸馏水，用玻璃棒将羽根压集于管底，以适当的压力转动玻璃棒，挤压出羽髓后倾斜试管，用毛细管顺次加到外周受检孔中（2、3、5、6孔）。中心孔加入MD阳性血清，外周1、4孔加入标准抗原。加样完毕，盖上平皿，做好标记、编号，放入带盖湿盒中，置37 ℃温箱内24～48 h，观察并做详细记录。

    注意事项：应多拔几根新羽来检查；加样时，以把孔加满为度，切忌样品溢出，影响判定结果；与邻接孔连片时应作废处理；MD阳性血清避免反复冻融，以防降低效价而影响检出结果；在琼脂扩散试验时，还要注意羽囊同边缘孔紧密吻合，防止羽囊径小，边缘孔大，抗原扩散不充分，降低查检率。

    判定标准：标准抗原与标准阳性血清两孔间形成清晰的白色沉淀线。被检材料孔与标准试剂孔间出现明显的沉淀线，或标准阳性试剂间的沉淀线末端向被检材料一侧曲，判为阳性。有的被检材料可能出现1条以上的沉淀线，仍判为阳性。无沉淀线则为阴性。

    1.2.4 病毒学诊断（病毒分离） 分离病毒的材料，采用病鸡的抗凝血，由于MDV具有高度的细胞结合性，在分离材料的处理过程中，除保持无菌条件外，还必须保持分离细胞的生理活性。

    （1）鸡胚接种法。试验组：将0.1 mL的病料分别接种于10只4～5日龄鸡胚卵黄囊内，分别于接种后4～6 d和10～11 d观察绒毛尿囊膜上是否产生典型的疱疹病毒痘斑。对照组：将0.1 mL的抗凝剂分别接种于10只4～5日龄鸡胚卵黄囊内，分别于接种后4～6 d和10～11 d观察，与试验组进行对照。

    （2）雏鸡接种法。试验组：选择1日龄或1周龄的易感鸡10只，将病料如病鸡的抗凝血0.5 mL经腹腔接种，然后严格隔离饲养观察，接种后18～21 d，观察是否产生鸡马立克氏病的特征性病理变化。对照组：选用抗凝剂0.5 mL经腹腔接种，同时隔离饲养观察，与试验组进行对照。

    2 结果与分析

    2.1 病理剖检结果

    在送检的30只病死鸡中，22只出现坐骨神经、迷走神经等单侧性神经肿大而变粗，呈黄白色水肿样变化；21只出现肝脏肿大、质脆，表面观察到大小不等的白色结节；17只出现心外膜可见绿豆至黄豆大小的白色结节，形状呈球形、椭园形或不规则形，结节突出于心脏表面致使心外膜凹凸不平；15只出现脾脏肿大，包膜紧张，切面膨隆外翻；18只出现肾脏肿大，前肾隆起凸入腹腔，可见大小不等的灰白色结节；22只腺胃黏膜乳头肿胀，乳头之间可见出血斑；23只肌胃角质膜下观察到线状出血斑；16只十二指肠黏膜充血或出血病变；20只盲肠扁桃体肿胀、出血；22只泄殖腔黏膜线状出血病变；20只法氏囊出现萎缩。4只无明显剖检病理变化。

    2.2 病理组织切片结果

    2.2.1.心脏 心肌纤维颗粒变性、水泡变性。在血管周围、肌纤维间、心外膜下有淋巴细胞呈浸润性增生。肌纤维脂肪变性，局部蜡样坏死。

    2.2.2 脾脏 鞘动脉周围、淋巴小结出现大量淋巴细胞、网状细胞。淋巴细胞核碎裂、边集，并见核分裂相。

    2.2.3 肝脏 肝细胞颗粒变性、水泡变性、部分坏死。窦周隙狭窄，散在少量的红细胞和淋巴细胞。中、小淋巴细胞、网状细胞在静脉周围浸润。在肝小叶内局灶性增生。增生灶内有呈空泡状的原始网状细胞和核边集的凋亡淋巴细胞。肝细胞坏死处有淋巴细胞集聚。

    2.2.4 肾脏 肾小球体积增大。肾小囊腔狭窄。并有血红蛋白样物质。肾小囊壁上皮细胞肿胀。局部肾小球萎缩，出现代偿性增大。肾小管上皮细胞从颗粒变性、水泡变性到细胞坏死、胞膜破裂，整个肾小管呈均质红染。肾小管内有血红蛋白样物质，呈尿管型。

    2.2.5 坐骨神经 神经纤维间水肿液内散在中小淋巴细胞及浆细胞。局部灶性增生。

    2.2.6 卵巢 皮质和髓质见有结节性或弥漫性网状细胞、淋巴细胞集聚。淋巴细胞核显分裂相，局灶性增生细胞排列呈涡漩状。部分卵泡全部被多形态淋巴细胞所代替。

    2.2.7 腺胃 腺小管腺细胞开始呈颗粒变性、水泡变性，逐渐坏死，腺小管内散在流失的胞浆。淋巴细胞和网状细胞在腺小管间、肌层间、浆膜下浸润和增生。

    2.2.8 十二指肠 肌层肌细胞和肠绒毛上皮细胞变性、坏死。浆膜、浆膜下肌层、肠腺间和绒毛固有层出现不同程度的大中小淋巴细胞浸润和增生。肠腺间有网状细胞增生。

    2.2.9 肺 血管内、外散在淋巴细胞。血管周围肺小叶间隔有少量的淋巴细胞浸润，局部肺泡间隔及支气管周围充满大量的大中小淋巴细胞、少量的网状细胞。肺小叶内充满淋巴细胞、红细胞，局部实质内全被肿瘤细胞代替。

    2.3 血清学诊断的结果

    30份病料中，26份阳性，4份阴性。21份产生清晰可见的灰白色沉淀为阳性，5份产生一条以上的沉淀线，但仍属于阳性，4份无沉淀线则为阴性。

    2.4 病毒分离的结果

    通过试验组与对照组的比较，试验组雏鸡接种后可见肝、脾表面和切面均可见白色结节状肿瘤，肾、卵巢褪色、肿大等典型鸡马立克氏病的特征性病理变化。

    试验组鸡胚接种，在绒毛尿囊膜上可出现MDV引起典型疱疹病毒痘斑。在检查痘斑时应注意区别其他病原引起的类似痘斑。

    通过产生的这种典型疱疹病毒痘斑可对鸡马立克氏病进行确诊。

    3 防治措施

    3.1 加强饲养管理和卫生管理

    加强饲养管理，改善鸡群的生活条件，增强鸡体的抵抗力，对预防该病有很大的作用。饲养管理不善、环境条件差或某些传染病如球虫病等常是重要的诱发因素。定期搞好鸡舍尤其是出雏室和育雏舍的彻底消毒，防止雏鸡的早期感染是非常重要的，否则即使出壳后即刻免疫有效疫苗，也难防止发病。

    3.2 疫苗接种

    目前国内使用的疫苗有多种。按产地可分为进口疫苗和国内生产的疫苗。按血清型可分为三种，血清1型疫苗：主要是减弱弱毒力株CV1-988、814疫苗；血清2型疫苗：主要有SB-1、301B/1、Z4株；血清3型疫苗：即火鸡疱疹病毒HVT-FC126疫苗。按疫苗所有毒株种类，可分为单价苗、二价苗和三价苗等。自20世纪80年代开始，由于出现了超强毒，单价苗免疫失败屡屡发生，因此有些学者提出多价苗战略，并先后研制出多价苗，二价或三价苗等。

    4 小结

    本试验对30只病死鸡进行剖检诊断，病理组织切片观察，琼脂扩散试验和病毒分离试验进行诊断。病理剖检见坐骨神经、迷走神经单侧性肿大以及肝脏肿大、质脆等；光镜下，肝组织中集聚大量淋巴样细胞，心肌纤维间弥散大量多形性淋巴细胞；琼脂扩散试验结果为：26份阳性，4份阴性。将病料接种雏鸡，雏鸡均出现典型的鸡马立克氏病病理变化；病料鸡胚接种见绒毛尿囊膜上出现明显疱疹病毒痘斑；确诊30只疑似病例中，有26只患有鸡马立克氏病，4只无明显马立克氏病的明显症状。目前对该病尚无特效疗法，其防治关键是疫苗接种并同时做好综合防治。

    参考文献：

    [1] 金春富，赵福奎，吴常义.鸡马立克氏病的诊断及综合防制[J].畜牧兽医科技息，2010，（1）：79.

    [2] 霍击斯塔.禽病学（上册）[M].第2版，胡祥壁译.北京：中国农业大学出版社，1983.