五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞氧化损伤的影响
杨杰 卫东锋 王文潇 程卫东
摘要：目的 观察五指毛桃药物血清对老龄小鼠衰老所致脾淋巴细胞氧化损伤的影响，探讨其作用机制。方法 将40只老龄小鼠随机分为空白对照组和五指毛桃高、中、低剂量组，分别给予0.9%氯化钠溶液和6.6、4.4、2.2 g/kg五指毛桃水提物灌胃，测定脾脏指数，确定五指毛桃水提物的最佳剂量，采用MTT法确定最佳剂量药物血清干预老龄小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳稀释浓度及最佳作用时间。使用最佳稀释浓度药物血清作用老龄小鼠脾淋巴细胞48 h后观察衰老细胞阳性率，检测细胞内总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量。结果 与空白对照组比较，药物组老龄小鼠脾脏指数均明显提高（P<0.05，P<0.01），以中剂量组效果最佳；五指毛桃药物血清促进老龄小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳浓度为20%，最佳作用时间为48 h。20%五指毛桃药物血清明显降低衰老细胞阳性率（P<0.01），提高老龄小鼠T-SOD活性，降低MDA和ROS含量（P<0.05，P<0.01）。结论 五指毛桃药物血清能够提高老龄小鼠脾淋巴细胞增殖活性，其机制与降低衰老细胞阳性率、增强细胞抗氧化能力有关。
关键词：五指毛桃；药物血清；脾淋巴细胞；衰老；氧化损伤；老龄小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0052-04
Effects of Drug-containing Serum of Ficus Hirta on Oxidative Damage of Spleen Lymphocyte in Aged Mice YANG Jie1，2， WEI Dong-feng3， WANG Wen-xiao2， CHENG Wei-dong1 （1. Institute of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China； 2. School of Basic Medical Science of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
Abstract： Objective To study the effects of drug-containing serum of Ficus Hirta on oxidative damage of spleen lymphocyte due to aging in aged mice； To discuss its mechanism of action. Methods Forty aged mice were randomly divided into control group and high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups. Control group was given 0.9% sodium chloride solution for gavage， while high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups were given 6.6， 4.4， and 2.2 g/kg aqueous extract of Ficus Hirta for gavage. The spleen index was observed for optimum dose in aged mice. The optimum time and dilution of drug-containing serum of Ficus Hirta were confirmed by MTT method in lymphocyte proliferation test. The positive rate of senescent cells， the activity of T-SOD and the contents of MDA and ROS were determined in cellular antioxidant experiment after treated by optimal drug-containing serum for 48 h. Results Compared with the control group， the spleen index was significantly improved in high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups （P<0.05， P<0.01）. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta cultivated for 48 h had the best effects on lymphocyte proliferation in aged mice. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta could significantly decrease the positive rate of senescent cells （P<0.01）， improve T-SOD activity and decrease the contents of MDA and ROS （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The drug-containing serum of Ficus Hirta can improve the proliferative activity of spleen lymphocyte in aged mice and the mechanism of action may be involved in decreasing the positive rate of senescent cells and increasing antioxidant ability of lymphocyte.
Key words： Ficus Hirta； drug-containing serum； spleen lymphocytes； aging； oxidative damage； aged mice
五指毛桃以桑科榕属植物粗叶榕Ficus hirta Vahl.的干燥根入药，其味甘、辛，性平，具有补气健脾、利湿舒筋等功效，常用于治疗肺脾气虚、风湿痹痛、肺痨咳嗽等。因其与黄芪作用相当，且主要产于我国岭南地区，故又称“南芪”。以往研究发现，南芪、北芪均有增强小鼠细胞免疫力的作用，但南芪作用效果较为显著[1]。五指毛桃中活性成分如黄酮、多糖、多酚、氨基酸均有较强清除自由基的作用，且其中黄酮、氨基酸和多酚相对于其他植物抗氧化活性更强[2]，对机体氧化损伤具有明显的保护作用。本实验采用血清药理学方法，观察五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞氧化损伤的影响，为五指毛桃的临床应用及药物研发提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级昆明种青龄小鼠50只，6月龄，雌雄各半，体质量（20±2）g；清洁级昆明种老龄小鼠60只，18月龄，体质量（20±2）g，雌雄各半。均由兰州大学医学动物实验中心提供，许可证号SCXK（甘）2009-0004。饲养温度为（20±2）℃，12 h昼夜交替动物房中，自由进食。
1.2 药物
五指毛桃由南方医科大学中医药学院程卫东教授提供并鉴定。五指毛桃水提物制备：将药材加入适量水中浸泡0.5～1 h，煎煮3次，第1次1.5 h，第2次1 h，第3次0.5 h，合并3次滤液，将所得滤液浓缩至1 g原药材/mL，4 ℃保存备用。
1.3 主要试剂与仪器
四甲基偶氮唑盐（MTT）、刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖，美国Sigma公司；RPMI-1640培养基，恒生生物工程有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS），天津化学试剂一厂；EZ-SepTM小鼠淋巴细胞分离液，深圳达科为生物技术有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，碧云天生物技术研究所；总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、细胞内活性氧（ROS）试剂盒，南京建成生物工程研究所。CO2培养箱（日本SANYO公司），680型酶标仪（美国Bio-Rad公司），XL型流式细胞仪（美国贝克曼COULTER公司），JY92-2D超声细胞粉碎机（宁波新芝公司）。
2 实验方法
2.1 动物分组及药物血清和脾淋巴细胞悬液制备
将40只老龄小鼠随机分为空白对照组和五指毛桃高、中、低剂量组，每组10只。空白对照组给予0.9%氯化钠溶液灌胃，药物组按体质量分别给予高、中、低剂量（6.6、4.4、2.2 g/kg）五指毛桃水提物灌胃，1次/d，连续15 d。末次给药后，摘取脾脏，计算脾脏指数。根据脾脏指数选择五指毛桃水提物最佳剂量（4.4 g/kg）作用于青龄小鼠，1次/d，连续15 d，末次给药2 h后，制备药物血清[3]。
将青龄小鼠和老龄小鼠脱颈处死，无菌取脾脏，严格按照EZ-SepTM小鼠淋巴细胞分离物说明书操作提取脾淋巴细胞，各加入适量含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，分别调整为所需浓度，制备青龄小鼠和老龄小鼠的脾淋巴细胞悬液。
2.2 检测指标
2.2.1 五指毛桃药物血清与脾淋巴细胞增殖时效和量效关系测定 将上述制备的老龄小鼠脾淋巴细胞悬液，加入96孔板中，每孔100 μL。将“2.1”项中制备的各组药物血清用完全RPMI-1640培养液稀释为2.5%、5%、10%、20%、40% 5个浓度。每个浓度设8个复孔，同时设不加药物血清的老龄组和青龄组作为对照，分别培养24、48、72 h后，加入浓度5 g/mL MTT 10 μL，于CO2培养箱中继续培养4 h后，每孔加入100 μL 10%SDS，37 ℃过夜后摇匀，于酶标仪570 nm处测定OD值。根据MTT结果选择药物血清的最佳稀释浓度和培养时间。
2.2.2 衰老脾淋巴细胞增殖活性测定 取各组脾淋巴细胞按照细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行操作。镜下随机选择5个视野，按公式计算衰老细胞阳性率。衰老细胞阳性率（%）=衰老细胞数÷总细胞数×100%。
2.2.3 脾淋巴细胞总超氧化物歧化酶、丙二醛水平测定 将“2.1”项中收集的老龄小鼠脾淋巴细胞与最佳稀释浓度的药物血清培养“2.2.1”项中确定的最佳培养时间后，收集细胞，用超声波细胞破碎仪在冰上破碎细胞，严格按照T-SOD和MDA试剂盒说明书进行操作。
2.2.4 脾淋巴细胞活性氧水平测定 将“2.1”项收集的老龄小鼠脾淋巴细胞与各组药物血清共同培养。收集的细胞严格按照ROS试剂盒说明书处理后，用流式细胞仪于488 nm激发波长、525 nm发射波长处检测其荧光强度。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，并做方差齐性检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 五指毛桃水提物对老龄小鼠脾脏指数的影响
与空白对照组比较，五指毛桃高、中剂量组老龄小鼠脾脏指数明显提高，且中剂量组效果显著（P<0.01），见表1。故选用中剂量五指毛桃水提物给予青龄小鼠灌胃制备药物血清。
4.2 五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响
与老龄组比较，稀释浓度为10%、20%、40%五指毛桃药物血清均能明显提高老龄小鼠脾淋巴细胞增殖活性（P<0.05，P<0.01），并呈现一定的时-效和量-效关系。随着细胞培养时间的延长，脾淋巴细胞的增殖活性呈现先升后降的现象；空白血清稀释浓度为20%和40%时，也可提高老龄小鼠脾淋巴细胞细胞增殖活性，但仍比五指毛桃药物血清组水平低。与空白血清组比较，培养48 h，稀释浓度为20%五指毛桃药物血清对脾淋巴细胞增殖的刺激效果最佳（P <0.01），见表2。因此，将稀释浓度为20%、培养时间为48 h的五指毛桃药物血清作为后续实验研究的条件。
摘要：目的 观察五指毛桃药物血清对老龄小鼠衰老所致脾淋巴细胞氧化损伤的影响，探讨其作用机制。方法 将40只老龄小鼠随机分为空白对照组和五指毛桃高、中、低剂量组，分别给予0.9%氯化钠溶液和6.6、4.4、2.2 g/kg五指毛桃水提物灌胃，测定脾脏指数，确定五指毛桃水提物的最佳剂量，采用MTT法确定最佳剂量药物血清干预老龄小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳稀释浓度及最佳作用时间。使用最佳稀释浓度药物血清作用老龄小鼠脾淋巴细胞48 h后观察衰老细胞阳性率，检测细胞内总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量。结果 与空白对照组比较，药物组老龄小鼠脾脏指数均明显提高（P<0.05，P<0.01），以中剂量组效果最佳；五指毛桃药物血清促进老龄小鼠脾淋巴细胞增殖的最佳浓度为20%，最佳作用时间为48 h。20%五指毛桃药物血清明显降低衰老细胞阳性率（P<0.01），提高老龄小鼠T-SOD活性，降低MDA和ROS含量（P<0.05，P<0.01）。结论 五指毛桃药物血清能够提高老龄小鼠脾淋巴细胞增殖活性，其机制与降低衰老细胞阳性率、增强细胞抗氧化能力有关。
关键词：五指毛桃；药物血清；脾淋巴细胞；衰老；氧化损伤；老龄小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0052-04
Effects of Drug-containing Serum of Ficus Hirta on Oxidative Damage of Spleen Lymphocyte in Aged Mice YANG Jie1，2， WEI Dong-feng3， WANG Wen-xiao2， CHENG Wei-dong1 （1. Institute of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China； 2. School of Basic Medical Science of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
Abstract： Objective To study the effects of drug-containing serum of Ficus Hirta on oxidative damage of spleen lymphocyte due to aging in aged mice； To discuss its mechanism of action. Methods Forty aged mice were randomly divided into control group and high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups. Control group was given 0.9% sodium chloride solution for gavage， while high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups were given 6.6， 4.4， and 2.2 g/kg aqueous extract of Ficus Hirta for gavage. The spleen index was observed for optimum dose in aged mice. The optimum time and dilution of drug-containing serum of Ficus Hirta were confirmed by MTT method in lymphocyte proliferation test. The positive rate of senescent cells， the activity of T-SOD and the contents of MDA and ROS were determined in cellular antioxidant experiment after treated by optimal drug-containing serum for 48 h. Results Compared with the control group， the spleen index was significantly improved in high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups （P<0.05， P<0.01）. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta cultivated for 48 h had the best effects on lymphocyte proliferation in aged mice. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta could significantly decrease the positive rate of senescent cells （P<0.01）， improve T-SOD activity and decrease the contents of MDA and ROS （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The drug-containing serum of Ficus Hirta can improve the proliferative activity of spleen lymphocyte in aged mice and the mechanism of action may be involved in decreasing the positive rate of senescent cells and increasing antioxidant ability of lymphocyte.
Key words： Ficus Hirta； drug-containing serum； spleen lymphocytes； aging； oxidative damage； aged mice
五指毛桃以桑科榕属植物粗叶榕Ficus hirta Vahl.的干燥根入药，其味甘、辛，性平，具有补气健脾、利湿舒筋等功效，常用于治疗肺脾气虚、风湿痹痛、肺痨咳嗽等。因其与黄芪作用相当，且主要产于我国岭南地区，故又称“南芪”。以往研究发现，南芪、北芪均有增强小鼠细胞免疫力的作用，但南芪作用效果较为显著[1]。五指毛桃中活性成分如黄酮、多糖、多酚、氨基酸均有较强清除自由基的作用，且其中黄酮、氨基酸和多酚相对于其他植物抗氧化活性更强[2]，对机体氧化损伤具有明显的保护作用。本实验采用血清药理学方法，观察五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞氧化损伤的影响，为五指毛桃的临床应用及药物研发提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级昆明种青龄小鼠50只，6月龄，雌雄各半，体质量（20±2）g；清洁级昆明种老龄小鼠60只，18月龄，体质量（20±2）g，雌雄各半。均由兰州大学医学动物实验中心提供，许可证号SCXK（甘）2009-0004。饲养温度为（20±2）℃，12 h昼夜交替动物房中，自由进食。
1.2 药物
五指毛桃由南方医科大学中医药学院程卫东教授提供并鉴定。五指毛桃水提物制备：将药材加入适量水中浸泡0.5～1 h，煎煮3次，第1次1.5 h，第2次1 h，第3次0.5 h，合并3次滤液，将所得滤液浓缩至1 g原药材/mL，4 ℃保存备用。
1.3 主要试剂与仪器
四甲基偶氮唑盐（MTT）、刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖，美国Sigma公司；RPMI-1640培养基，恒生生物工程有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS），天津化学试剂一厂；EZ-SepTM小鼠淋巴细胞分离液，深圳达科为生物技术有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，碧云天生物技术研究所；总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、细胞内活性氧（ROS）试剂盒，南京建成生物工程研究所。CO2培养箱（日本SANYO公司），680型酶标仪（美国Bio-Rad公司），XL型流式细胞仪（美国贝克曼COULTER公司），JY92-2D超声细胞粉碎机（宁波新芝公司）。
2 实验方法
2.1 动物分组及药物血清和脾淋巴细胞悬液制备
将40只老龄小鼠随机分为空白对照组和五指毛桃高、中、低剂量组，每组10只。空白对照组给予0.9%氯化钠溶液灌胃，药物组按体质量分别给予高、中、低剂量（6.6、4.4、2.2 g/kg）五指毛桃水提物灌胃，1次/d，连续15 d。末次给药后，摘取脾脏，计算脾脏指数。根据脾脏指数选择五指毛桃水提物最佳剂量（4.4 g/kg）作用于青龄小鼠，1次/d，连续15 d，末次给药2 h后，制备药物血清[3]。
将青龄小鼠和老龄小鼠脱颈处死，无菌取脾脏，严格按照EZ-SepTM小鼠淋巴细胞分离物说明书操作提取脾淋巴细胞，各加入适量含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，分别调整为所需浓度，制备青龄小鼠和老龄小鼠的脾淋巴细胞悬液。
2.2 检测指标
2.2.1 五指毛桃药物血清与脾淋巴细胞增殖时效和量效关系测定 将上述制备的老龄小鼠脾淋巴细胞悬液，加入96孔板中，每孔100 μL。将“2.1”项中制备的各组药物血清用完全RPMI-1640培养液稀释为2.5%、5%、10%、20%、40% 5个浓度。每个浓度设8个复孔，同时设不加药物血清的老龄组和青龄组作为对照，分别培养24、48、72 h后，加入浓度5 g/mL MTT 10 μL，于CO2培养箱中继续培养4 h后，每孔加入100 μL 10%SDS，37 ℃过夜后摇匀，于酶标仪570 nm处测定OD值。根据MTT结果选择药物血清的最佳稀释浓度和培养时间。
2.2.2 衰老脾淋巴细胞增殖活性测定 取各组脾淋巴细胞按照细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行操作。镜下随机选择5个视野，按公式计算衰老细胞阳性率。衰老细胞阳性率（%）=衰老细胞数÷总细胞数×100%。
2.2.3 脾淋巴细胞总超氧化物歧化酶、丙二醛水平测定 将“2.1”项中收集的老龄小鼠脾淋巴细胞与最佳稀释浓度的药物血清培养“2.2.1”项中确定的最佳培养时间后，收集细胞，用超声波细胞破碎仪在冰上破碎细胞，严格按照T-SOD和MDA试剂盒说明书进行操作。
2.2.4 脾淋巴细胞活性氧水平测定 将“2.1”项收集的老龄小鼠脾淋巴细胞与各组药物血清共同培养。收集的细胞严格按照ROS试剂盒说明书处理后，用流式细胞仪于488 nm激发波长、525 nm发射波长处检测其荧光强度。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，并做方差齐性检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 五指毛桃水提物对老龄小鼠脾脏指数的影响
与空白对照组比较，五指毛桃高、中剂量组老龄小鼠脾脏指数明显提高，且中剂量组效果显著（P<0.01），见表1。故选用中剂量五指毛桃水提物给予青龄小鼠灌胃制备药物血清。
4.2 五指毛桃药物血清对老龄小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响
与老龄组比较，稀释浓度为10%、20%、40%五指毛桃药物血清均能明显提高老龄小鼠脾淋巴细胞增殖活性（P<0.05，P<0.01），并呈现一定的时-效和量-效关系。随着细胞培养时间的延长，脾淋巴细胞的增殖活性呈现先升后降的现象；空白血清稀释浓度为20%和40%时，也可提高老龄小鼠脾淋巴细胞细胞增殖活性，但仍比五指毛桃药物血清组水平低。与空白血清组比较，培养48 h，稀释浓度为20%五指毛桃药物血清对脾淋巴细胞增殖的刺激效果最佳（P <0.01），见表2。因此，将稀释浓度为20%、培养时间为48 h的五指毛桃药物血清作为后续实验研究的条件。
