毛蚶组织切片的制作和观察

    梁久征 王丽远 庞宝成

    

    摘 要：以毛蚶组织为试验材料，使用苏木精 — 伊红染色法（HE染色法） ，对毛蚶组织结构进行固定、切片、染色。将制作的组织切片放在显微镜下，观察其组织结构特点，探讨贝类组织切片制作的各个技术要素。

    关键词：毛蚶组织；HE染色法；石蜡切片

    HE染色法，是使用切片机把组织结构切成片层。选取的组织，经过固定、脱水、切片、染色等程序，然后，经过物理、化学的处理。在进行操作时，要注意根据不同性质的材料，选择相对比较合理的方法进行处理。是生物学和组织学广泛应用的染色法。切片法，能保障细胞与细胞在切片过程中，保持正常的组织关系，更好地保护组织细胞的原貌不被损坏，是光学显微镜的主要制片方法。

    1 实验材料及方法

    1.1 实验材料

    95%乙醇、中性树胶、固体石蜡、氨水、鸡蛋、甘油、冰醋酸、甲醛、盐酸羟胺、苏木素、伊红、钾明矾、活鱼、苦味酸、水合氯醛、碘酸钠、明矾、柠檬酸、肝素钠、毛蚶（在市场购得）。

    1.2 实验仪器及设备

    苏木素伊红（HE）染色试剂盒、载玻片、盖玻片、玻璃棒、瑞氏吉姆萨复合染液试剂盒、毛笔两支、镊子2个、电炉1个、洗衣粉、500 mL烧杯6个、染色缸20个、染色架5个、1 mL注射器2个、5 mL注射器2个、1 000 mL烧杯2个。

    1.3 实验所需试液的配制

    1.3.1 福尔马林溶液 甲醛10 mL、蒸馏水90 mL，配500 mL。

    1.3.2 苏木素[1]染液配制 蒸馏水 1 000 mL将碘酸钠 0.2 g加热到100 ℃后加入苏木精 1 g，呈樱桃红色，然后加入硫酸铝钾 50 g，使其变成蓝紫色，继续加温煮沸5 min后，加入50 g水合氯醛继续搅拌，此时溶液应该为红紫色，溶解完后加1 g柠檬酸，然后取下冷却，此液可长期保存。若陈液水分蒸发可加适量2%钾矾液稀释[2]。

    1.3.3 1%的伊红溶液 称取伊红1 g，加100 mL蒸馏水溶解，用时加3滴冰醋酸。

    1.3.4 70%，80%，90%酒精溶液 用无水乙醇分别与水比例为70∶30、80∶20、90∶10配制相应浓度的酒精溶液。

    1.4 实验操作

    1.4.1 溶液配制 配制福尔马林溶液，苏木素染液，1%的伊红溶液，70%、80%、90%酒精溶液待用。

    1.4.2 制作血涂片 用5 mL注射器在鲫鱼尾静脉采取血液1 mL，再吸取2 mL肝素钠抗凝血。在载玻片的一端滴一滴血液标本，推片与载玻片呈30～45°夹角，从血滴前端接触血液并使血滴沿着推片均匀地散开，使血滴形成薄薄的一层血膜，然后在阴凉处风干。然后再做四个血涂片，其中第一个做空白对照，两个用瑞士染液染色，两个用吉姆萨染液染色。风干后清洗再晾干，最后在显微镜下观察血细胞结构特点。

    1.4.3 切片制作

    1.4.3.1 玻片处理 在烧杯中加入适量水与洗衣粉，将新载玻片置于烧杯中，加热煮沸15～20 min，小水流冲24 h，滤纸擦净后使用。

    1.4.3.2 取材 尽量取最新鲜组织，如有污物用水洗干净然后滤纸吸干。一旦组织离开鱼体，组织会以惊人的速度迅速固定，所以取新鲜组织来保证组织原本的形态学结构。

    组织块大小：斯顿伯格L.A指出，切片厚度的轻微变化，对组织化学定量结果的重复性产生极大的影响[3]。目前已有的确定组织切片厚度的方法，多以切片机标记的切片厚度作为切片的真实厚度；或者测量组织块在切片过程中变薄的变化，推算组织切片的平均厚度[4]。所取组织体积1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部[5]。

    取材部位：切片一定要把组织的结构特点全部显示出来，材料的选取是关键。取材必须避免人为改变组织形态，取材刀剪锋利，夹取时不要挤压组织，组织固定以后，容易收缩，要将组织展平，从而显示组织完整结构。取材对石蜡组织切片制作至关重要，把握好取材，也就成功了一半。取材部位为鳃、肝脏、肾脏、脾脏、肠。

    1.4.3.3 固定与清洗 取不同组织，两组用①②代表，分别置于纱布中包好，在固定液中固定24 h以上，然后取出各组织进行修块，修块大小为1 cm×1 cm×0.5 cm，修块后再固定6～7 h。将之前固定好的组织纱布块再放于大烧杯中，在烧杯口上盖上纱布，并使烧杯略微倾斜，用小水流自来水冲洗24 h。

    将组织放于固定液中，目的是防止细菌繁殖和酶作用使组织腐败或自溶，使组织和细胞的固有形态、结构得以保存[6]。清洗的目的是洗掉固定液，同时冲洗也可以改变组织硬度，使切片制作变得简单和更易于组织结构的观察与分析。

    1.4.3.4 脱水与透明 将组织分别移入70%酒精，80%酒精，90%酒精，95%酒精中，各个浸泡12 h，然后100%酒精①②各浸泡2 h，蘸干后再浸泡于无水酒精和二甲苯1∶1混合液10 min，二甲苯①②各20 min，使二甲苯将酒精替换出来。

    1.4.3.5 浸蜡 提前8 h将石蜡放入60 ℃烘箱融化，反复两次再用。在60 ℃烘箱中浸蜡，否则脆，浸蜡3 h。

    1.4.3.6 包埋 把牛皮纸做成小纸盒并在小纸盒底部标注组织名称，先将熔好的蜡倒入小纸盒中，再把浸蜡后的组织分别至于小纸盒中，石蜡凝固后组织被抱在其中，包埋后的组织可长久保存。

    1.4.3.7 切片 视组织的大小，在靠近组织约0.1～0.2 cm的地方切掉多余的蜡，不然可能会容易使组织褶皱不平；把修好的蜡块放置在金属持蜡器上；把切片刀安装在切片机的刀台上，把刀台上的紧固螺丝适当拧紧，使切片时比较稳定，从而能使切片厚度误差减小；一般情况下石蜡切片的厚度保持在4～6μm；用镊子小心地将切好的蜡带轻轻平铺在42 ℃的水面上，借水的温度和张力，将略皱的蜡带自然展平；待到切片在恒温水面上充分展开后，将蜡片捞到载玻片的中间，然后倾斜载玻片使载玻片上的余水流失，再置于60～65 ℃烘箱内恒温烤片3 h，使熔化在组织间隙的石蜡完全脱去，从而组织与玻片紧密结合。

    1.4.3.8 染色和封片[7]

    烘箱中取出的玻片先于二甲苯①②中各10 min，擦干后再移入酒精100%，95%，90%，80%，70%各2 min，蒸馏水2 min，然后移入苏木素中染色8～9 min，取出擦干，在盐酸酒精中放下去1秒然后拿出，反复3次，再用自来水小水流冲20 min。

    冲洗后于伊红中染色7～10 min，再分别于70%、80%、90%酒精中各洗3次，擦干后于95%酒精①②，100%酒精①②各5 min，二甲苯①②各10 min，最后用中性树胶封片，1～2 d后显微镜观察照相。

    2 结果与分析

    2.1 染色结果

    毛蚶心脏血细胞染色情况（图1）：细胞膜显示为淡红色，可以明显地看出细胞核结构。染色不明显。毛蚶血液中，含有淋巴样细胞、巨噬细胞、白细胞和嗜碱性细胞等

    图1 毛蚶血涂片（瑞氏染色）

    外套膜染色切片（图2），染色较为明显，颜色为红色。可以明显地看出分层结构。组织分为两层，外面一层膜状结构为淡黑色，规范地包围着内部结构，起着很好的保护作用，内部呈现明显的条纹状、区分明显。但是由于切片时不太规范，导致切片不太完整，所以看到的图片也不完整，中间出现明显的断裂。

    图2 毛蚶外套膜肌肉组织40倍

    图3 毛蚶肠组织组织10倍

    毛蚶肠组织的内表面形成皱襞，皱襞上含小肠绒毛，增加了消化食物、吸收营养的表面积。肠道染色不太明显，但是可以看到明显的组织结构。结构分明显的两层，外面一层壁状结构，包围着内部的触角状的结构，颜色淡红。

    2.2 总结分析

    总体来说，本次实验还算是成功的，因为染色结果比较明显，毛蚶的组织结构区分、染色明显。但是具体来说，此次实验组存在很多不足之处，比如应该更加注意实验操作的规范性。

    在制作蜡块和切片的时候，第一次切片制成的蜡带十分不整齐，在重复了很多次之后，才真正地切除了蜡带，这个过程，不能操之过急。还有就是对于实验步骤的熟悉，以及每一个步骤时间的把握一定要准确，连贯，避免因为耽搁时间过长，导致实验产生误差。

    参考文献：

    [1]

    郑伟.苏木素染液中媒染剂用量的探讨[J].解剖学杂志.2006，29（1）： 21-29

    [2] 梅立新，张旭晨.苏木素染液简易配置法及应用[J].承德医学院学报.1997，14（1）：59

    [3] 斯顿伯格 LA.免疫细胞化学[M].北京：原子能出版社，1982.130

    [4] Pakkenberg B，Guandersen HJG.Total number of neurons and glial cells in human brain nuclei estimated by the disector and the fractionator：J.Microsc，1988，150：1

    [5] 龚志锦.病理组织制片和染色技术[M].上海：上海科学技术出版社，1994

    [6] 王凤龙.动物病理及检验技术[M].呼和浩特：内蒙古大学出版社，2006

    [7] 刘明生，李川.杂交鲟幼鱼烂鳃病、气泡病组织病理学观察[J].河北渔业.2012（3）：28-61