水产品中氯霉素类药物残留检测的衍生化条件
綦天华++张慧峰++杨扬++修磊++杨春桥++韩立中
氯霉素是一类具有广谱抗菌作用的抗生素类药物，应用在水产上可防治烂鳃和赤皮病等，但其对人类有很大的毒害作用，且代谢较慢，不易排出体外，目前被很多国家禁用，该药残留为我国申报无公害产品或进出口时的必检项目，对于该药的残留目前主要通过气相色谱法完成。但该法衍生化过程复杂，且可导致回收率偏低的因素较多。本文就衍生化中影响回收率的三个重要影响因素进行了系统分析，通过正交试验法对其残留量的衍生化条件进行了优化，得到了氯霉素残留量衍生化的最优条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器与设备 气相色谱仪 Agilent 6890N（配63Ni电子捕获检测器）；旋转蒸发仪 BUCHI R-215；离心机 上海安亭TDL-40B；漩涡混合器 德国IKA MS3 DS25；氮吹仪 航川奥盛 KD200。
1.1.2 试剂与药品 氯霉素标准品含量99.5%（Sigma C-0378）；乙酸乙酯（色谱纯） ；甲醇（色谱纯） ；氯化钠（分析纯） ； 正己烷（色谱纯） ；三氯甲烷（色谱纯） ；乙腈（色谱纯） ；硅烷化试剂：BSTFA + T CMS （99∶1） （美国Supelco 公司） ；固相萃取小柱（SPE） ： ENVI-18 （3 mL ，美国Supelco 公司）。
1.1.3 样品及其制备 用于实验的材料为淡水鲫鱼，去鳞、皮，沿背脊取肌肉；样品切为不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混匀，放置冰箱中冷冻贮存备用。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的制备 取氯霉素标准品0025 g，甲醇定容到50 mL，浓度为500 μg/mL，4 ℃冰箱中保存待用。临用前取该贮备液，稀释为0.100 μg/mL的标准工作液。
1.2.2 工作曲线的制备 取标准工作液，用甲醇稀释，制备成浓度为0.1、0.5、20、50、100、200、500 μg/mL的标准使用液，分别置于5 mL玻璃离心管中，50 ℃干热尽干，加入100 μL衍生化试剂，70 ℃恒温加热30 min，用氮气吹干多余试剂，用0.5 mL正己烷溶解待用。测定峰高的响应值，以峰高值对质量浓度做工作曲线。
1.2.3 色谱条件 色谱柱：DB-5石英毛细管柱，固定相：SE-54（聚甲基苯基乙烯基硅氧烷），30 m×0.53 mm×0.5 μm。载气：氮气，线速度29 cm/s，进样口温度：260 ℃。温度程序：初始柱温150 ℃，维持1 min，15 ℃/min升至260 ℃，维持10 min，然后设定30 ℃/min升至280 ℃，维持5 min，以确保所有的样品已经流出。检测器温度：300 ℃。进样方式及进样量：无分流方式进样，1 μL。检测器：63Ni电子捕获检测器。
1.2.4 加标样品的制备 取待测空白样品5 g，加入浓度为0.100 μg/mL的标准溶液1 mL，各样品作2个平行样，根据公式计算得到加标浓度为20 μg/kg。
1.2.5 衍生化单因素实验 将冰箱冷冻储存的样品室温解冻，依据水产品行业标准[1]依次进行提取脱脂净化，氮气吹干得到干燥的残留物。接下来进行衍生化的单因素实验，具体单因素及水平见表1，具体操作步骤如下：向干的残留物中加100 μL衍生化试剂，盖塞并旋涡混合10 s，在70 ℃（55 ℃、70 ℃、85 ℃）烘箱中反应30 min（20 min、30 min、40 min）。再在50 ℃（35 ℃、50 ℃、65 ℃）砂浴中用氮气流吹除多余的试剂，至样品管刚好吹干为止。加入0.5 mL正己烷，旋涡混合10 s，供气相色谱分析用。
2.2 衍生化温度对氯霉素残留加标回收率的影响
三个温度下的气相图谱分别见下图3、4、5，回收率结果见表2。
结论：通过根据外标法标准曲线，计算结果显示衍生化温度为60 ℃时回收率最高。
2.3 衍生化时间对氯霉素残留加标回收率的影响
结论：通过根据外标法标准曲线，计算结果显示衍生化时间为30 min时回收率最高。
2.4 衍生化砂浴温度对氯霉素残留加标回收率的影响
三个衍生化砂浴温度下的气相图谱分别见下图9、10、11，回收率结果见表4。
3 结论
正交试验优化得到的最佳衍生化条件是：衍生化温度60 ℃，衍生化时间30 min，砂浴温度45 ℃。根绝R值计算结果可知，R1>R2>R3，所以衍生化温度对于实验结果的影响最大，砂浴温度对于结果影响最小。优化得到的衍生化条件与行业标准相比略有不同。
参考文献：
[1]
SC/T 3018-2004，水产品中氯霉素残留量的测定[s].气相色谱法，北京：中国农业出版社，2004.2
（收稿日期：2015-11-09）
