HPLC—MS/MS法测定动物组织中氯霉素的残留

    杨德敏　刘良波

    摘要：为建立动物组织中氯霉素残留的液相色谱-串联质谱检测方法，以氯霉素-D5为内标，乙腈和4% NaCl溶液涡旋振荡提取动物组织中氯霉素，正己烷除去脂溶性杂质，再用水饱和乙酸乙酯液液萃取， 浓缩后HLB小柱净化，甲醇：水（50：50）定容，HPLC-MS/MS测定。采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式，多反应监测（MRM）方式检测，用氯霉素-D5作内标来定量。 结果表明，氯霉素检测的线性范围为0.5～10.0 μg/kg，r2=0.999 1，加标水平为0.2、0.4、1.0μg/kg时，平均回收率72.40%～114.20%，相对标准偏差小于11%，氯霉素的定量检测下限为0.2μg/kg 。说明该方法基质影响小，检测灵敏度高，检测结果准确，回收率好，适用于动物组织中氯霉素残留的检测。

    关键词：液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）；动物组织；氯霉素；残留

    中图分类号：R978.1+3 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）11-0014-02

    氯霉素（Chloramphenicol）属广谱抗生素，曾在畜牧业中广为应用，但在动物可食组织中的残留会通过食物链传给人类，长期微量摄入，不仅使人体肠道正常菌群失调[1]，而且还会抑制人体骨髓造血功能导致引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等疾病[2]。氯霉素残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视，欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。近年来，我国出口到欧盟、美国等地区的畜禽、水产品等多次因为氯霉素超标被限制，损失达到数十亿美元。我国禁止使用氯霉素，但仍存在用氯霉素治疗畜禽、水产品疾病的现象。

    目前国内外对氯霉素残留的研究集中在畜禽肌肉、水产品、虾及牛奶等的测定[3-6]，常用的检测方法包括气相色谱法、高效液相色谱法及气相色谱-质谱联用法等，现在多采用高效液相色谱-串联质谱联用方法（HPLC-MS/MS）。为了保障我国人民的健康及扩大动物性食品的贸易往来，有必要建立动物组织中氯霉素残留量专属、灵敏、定性、定量的高效液相色谱-串联质谱联用方法。

    1 材料与方法

    1.1 样品制备

    畜禽肉类，取可食用肌肉组织；畜禽肝脏可取整块；水产品类去皮后，取鱼肉部分，用高速匀浆机将其均质。

    1.2 仪器和试剂

    仪器：液相色谱-串联四级杆质谱仪Quattro Premier XE（美国Waters公司）；去离子水发生器；TL-18M型高速冷冻离心机；BS210S型电子天平（北京startorius公司）；OA-SYS型恒温水浴氮吹浓缩仪；MS1/MS2型涡旋振荡器；S180H型超声波。

    试剂：所用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲醇均为进口色谱纯；水为去离子水； 氯化钠为分析纯，4% NaCl溶液临用前配制；水饱和乙酸乙酯用50 mL水加400 mL乙酸乙酯超声30 min，静置分层后取上层乙酸乙酯用。

    1.3 HPLC色谱条件

    Waters超高效液相色谱柱 （WATERS ACQUITY UPLC？BEH C18柱50×2.1mm，1.7μm）；流动相：甲醇：水（50：50），用前过0.20 μm滤膜，除杂脱气；柱温：40 ℃；流速：0.25 mL/min；进样量：10 μL；运行时间1.5 min。

    1.4 质谱条件

    离子源：电喷雾离子源；扫描方式：多反应监测（MRM）；电离电压：2.8 kV；碰撞气：氩气3.0×10-3mbar；脱溶剂气速：500 L/hr；锥孔气速：20 L/hr。数据采集窗口：1.5 min；驻留时间：0.6 s。离子化模式：ESI-；质谱分辨率：单位分辨率；离子化温度：350 ℃；离子源温度：110 ℃。定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表1。

    1.5 标准溶液的配置

    氯霉素标准溶液：精密称量氯霉素标准品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解，再用甲醇稀释为1.0 ug/mL的标准中间液，再将其用流动相（甲醇：水=50：50）稀释为浓度0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL的标准系列，均含内标4 ng/mL。

    内标溶液：精密称量氯霉素-D5，用甲醇超声溶解为100 μg/mL的氯霉素-D5标准储备液，将其用流动相稀释为浓度40 ng/mL的使用液。

    1.6 样品处理

    称取5.00 g均质样品于50 mL离心管中，加入100 μL氯霉素-D5内标使用液（40 ng/mL），加入5 mL乙腈和5 mL 4% NaCl溶液涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液至另一50 mL离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液。加入5 mL正己烷脱脂净化两次，弃去正己烷层，水层用5mL水饱和乙酸乙酯提取两次，然后合并乙酸乙酯层在50 ℃下氮吹浓缩至干，加入1 mL甲醇涡旋1 min溶解待测物，加水至20 mL超声3 min混匀。依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis HLB（6cc 200 mg），20 mL待测物过柱，再用5 mL水洗柱子，抽干柱子后用6 mL甲醇洗脱接收，将接收液在50 ℃下氮吹浓缩至干，准确加入1.0 mL甲醇：水 （50：50），旋涡振荡30 s后超声2 min，过0.20μm 微孔滤膜后上HPLC-MS/MS分析。

    1.7 样品加标试验

    称取5.00 g不同类别阴性样品后，分别添加为氯霉素浓度0.2、0.4、1.0 μg/kg 的阳性样品，加入100 μL氯霉素-D5内标使用液（40 ng/mL），室温下放置20～30 min后进行样品处理后上机分析。

    2 结果与分析

    2.1 线性范围

    配制浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的标准系列，均含内标4 ng/mL。以质量浓度x（ng/mL）为横坐标，峰面积的比值y（氯霉素峰面积/氯霉素-D5峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为y = 0.220 312x ±0.033 617 3，r2 = 0.999 1。结果表明，氯霉素在0.5～10.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好。

    2.2 准确度和精密度试验

    分别称取禽类、猪肉、猪肝、水产品类阴性样品5.00 g，每类都添加氯霉素0.2、0.4、1.0 μg/kg，每个浓度水平取6个平行样，加入100 μL氯霉素-D5内标使用液（40 ng/mL），加标样品的回收率为72.40%～114.20%，相对标准偏差小于11%（表2），氯霉素-D5的回收率为82.9%～102.5%。

    2.3 定量检测下限

    样品中添加浓度为0.2 μg/kg时，定量离子信噪比S/N为10.51，回收率为72.40～108.60%，相对标准偏差小于11%，因此方法定量检测下限为0.2 μg/kg。

    2.4 样品的测定

    抽取市场中畜禽产品53批，水产品60批，其中鸡肉在一批样品中检出有氯霉素残留样品一批，其残留量为0.35 μg/kg。

    3 讨论

    3.1 提取溶液的选择

    氯霉素为中性化合物，可以用甲醇、乙腈、丙酮、和乙酸乙酯等溶剂提取，乙酸乙酯提取效率高但与水不互溶，当样品为干粉类含水量较少的动物组织时，提取效率明显降低。用乙腈加入4% NaCl溶液对各类干、湿动物组织样品中的氯霉素残留都有较高的提取效率，且加入4% NaCl溶液后能有效的降低提取物中蛋白质和油脂的含量，利于净化。

    3.2 提取方式的选择

    样品提取时，涡旋振荡、超声或者振荡提取都可以，但超声或振荡的时间要10 min，而涡旋振荡只2 min。样品批量少时可以选择涡旋振荡，批量多时可以选择超声或者振荡，能够大批量放入同时提取。

    3.3 流动相的选择

    有报道指出在负离子模式下用乙腈代替流动相中的甲醇会增强信号强度[10]。试验以乙腈：水（50：50）作为流动相，未观察到灵敏度的显著提高。而以甲醇：水（50：50）作为流动相，灵敏度已满足要求而且出峰时间缩短，提高检测效率。

    4 结论

    本方法受基质影响小，检测灵敏度高，检测结果准确，重现性好，适用于各类干、湿动物组织中氯霉素残留的检测。

    参考文献：

    [1] 文 卫，钮伟民，许伟芳.氯霉素残留检测技术的研究进展[J].现代预防医学，2007，34（1）： 67-68.

    [2] 王新丽.LC-MS/MS法测定鱼肉中氯霉素残留[J].中国卫生检验杂志，2007，17（3）：456 -457.

    [3] 杨大进，蒋定国，王竹天，等.畜禽肌肉、内脏及虾中氯霉素残留量的检测技术研究[J].卫生研究，2004，33（2）：198-199.

    [4] 白艳玲，陈剑刚，张彩虹，等.水产品中氯霉素残留量测定方法的研究[J].中国卫生检验杂志， 2005，15（6）：672-673.

    [5] 孙 亮，陈海东.GC-MS/MS测定虾仁中氯霉素的研究[J].中国卫生检验杂志，2003，13（3）：293.

    [6] 蒋定国.高效液相色谱法测牛奶中氯霉素残留量的研究[J].中国食品卫生杂志，2003，15（1）：36-38.