饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺稚螺生长、肌肉组成与免疫功能的影响

    冼健安+陈江+张秀霞+方哲+黄丹枫+王冬梅

    

    

    

    摘要：为探讨饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺稚螺生长、肌肉组成与免疫的影响，在基础饲料中添加三个不同浓度（1.2×107CFU/100 g、1.2×108CFU/100 g和1.2×109CFU/100 g）的乳酸菌，养殖初始体重为062 g的方斑东风螺10周。结果显示，与对照组相比，饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺稚螺的生长性能和肌肉组分均没有显著影响。饲料中添加1.2×107CFU/100 g乳酸菌能够显著提高方斑东风螺的超氧化物歧化酶（SOD）活性，但在添加量为1.2×108CFU/100 g和1.2×109CFU/100 g时SOD活性反而受到抑制;添加1.2×109CFU/100 g乳酸菌抑制酸性磷酸酶（ACP）活性;饲料中添加乳酸菌对过氧化氢酶（CAT）和碱性磷酸酶（AKP）活性没有显著影响。结果表明饲料中添加乳酸菌不影响方斑东风螺稚螺的生长性能和肌肉成分，添加量为1.2×107CFU/100 g时可一定程度上提高抗氧化活力，但较高的添加量对免疫功能会产生抑制作用。

    关键词：方斑东风螺;乳酸菌;免疫

    乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产大量乳酸的细菌，是动物和人类肠道中重要的生理性菌群之一，在自然界广泛分布。绝大多数乳酸菌对动物和人无毒、无害、无副作用，且在动物肠道体内担负着重要的生理代谢功能[1]。众多研究以及实践应用已表明将乳酸菌等有益菌制作成微生物制剂，应用到水产养殖中，具有增强水产动物机体免疫功能、提高抗病抗应激能力、促进生长等作用，且安全无毒、无污染、不产生抗药性，是抗生素的理想替代品之一。乳酸菌作为饲料添加剂已应用到凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）、草鱼（Cetenpharyngodon idellus）、石斑鱼（Epinephelus coioides）、刺参（Apostichopus japonicus）等水产动物中[2-6]，但在方斑东风螺饲料中的添加效果尚未见报道。本研究探讨饲料中添加不同含量的乳酸菌对方斑东风螺的生长性能、肌肉组分以及非特异性免疫功能的影响，以期为乳酸菌在方斑东风螺饲料中的合理应用提供一定的科学依据。

    1材料和方法

    1.1材料

     嗜酸乳酸菌（Lactobacillus acidophilus，细菌含量为6.0×108CFU/g）菌粉由中国热带农业科学研究院热带生物技术研究所提供。

    1.2饲料配制

     本饲料是以鱼粉为主要的蛋白源，α-淀粉为主要糖源，鱼油为主要脂肪源配制试验所需要的基础饲料。基础饲料组成及营养成分见表1。不添加乳酸菌的基础饲料为对照组，在基础饲料中分别添乳酸菌1.2×107CFU/100 g、1.2×108CFU/100 g和1.2×109CFU/100 g配制3种试验组饲料。各原料粉碎后过80目筛，然后按照配方称取原料，用饲料混合机混合均匀，再加入鱼油以及含有不同浓度枯草芽孢杆菌的水，混合揉成面团状软颗粒饲料，按照估算的日投喂量小份分装，置于-20 ℃冰箱保存，投喂前解冻至室温。

    表1基础饲料的组成及营养水平

    原料鱼粉豆粕α-淀粉酵母粉血球蛋白粉多维a多矿b胆碱鱼油多糖预混料含量/%46182242220.53.30.2营养水平粗蛋白粗脂肪灰分含量/%42.7613.109.36注：a多维：维生素A 2500000IU，维生素B1 7 g，维生素B2 45 g，维生素B5 10 g，维生素C 80 g，维生素D 5 g，维生素E 50 g，肌醇 60 g。

    b多矿：Ca 230 g，K 36 g，M g 9 g，Fe 8 g，Zn 30 g，Mn 2 g，Cu 1 g，Co 0.1 g，I 0.5 g， Se 0.04 g。

    1.3养殖管理

     养殖试验于2014年6-8月在海南省琼海市长坡镇椰林村某方斑东风螺养殖场内进行。方斑东风螺稚螺由该养殖场提供，选取同一批螺苗，暂养在30 cm×40 cm×35 cm规格的塑料箱中，用基础饲料驯养两周。挑选活力好、规格相近的个体作为试验稚螺，随机分配至各组中，每组3个重复。箱子底部铺上3～4 cm厚的沙子，海水进行过滤后用作试验用水，盐度30‰～31‰，水温27 ℃±2 ℃，流水养殖。饲料日投喂量为螺重的4%～5%，并根据实际摄食情况进行调整，每天19：00投喂。养殖周期为10周。

    1.4样品采集与指标测定

     东风螺取样前禁食24 h，统计存活率（SR）后，称量终末体重（FBW），计算试验方斑东风螺的增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和饲料系数（FC）。东风螺放入液氮中速冻，运至实验室置于-80 ℃冰箱保存。

    1.4.1生长性能

     增重率（weight gain rate，WGR，%）=100%×（螺终末平均体重-螺初始平均体重）/螺初始平均体重

     特定生长率（specific growth rate，SGR，%/d）=100%×（Ln螺终末平均体重-Ln螺初始平均体重）/饲养天数

     肉壳比 = 螺肉的质量（g）/螺壳的质量（g）

     存活率（survival rate，SR，%）=100×试验结束时螺的颗数/开始时螺的颗数

     脏体比（viscerosomic index，VSI，%）=100%×内脏团重（g）/螺体重（g）

     肥满度（condition factor，CF）=肉重（g）/螺体重（g）

    1.4.2饲料和肌肉营养组成用105 ℃烘箱干燥法测定饲料和螺肌肉的水分（GB/T6435-1986）;将烘干的饲料和螺肌肉组织粉碎，用凯氏定氮法测定饲料和螺肌肉的粗蛋白含量（GB/T6432-1994）;用索氏抽提法测定饲料和螺肌肉的粗脂肪含量（GB/T6433-1994）;采用550 ℃灼烧法测得灰分含量（GB/T6438-1992）。

    1.4.3免疫酶活性每个重复各随机选取3只螺，每饲料组共9只，每只螺的组织单独测定。在-80 ℃冰箱取出样品，待适当解冻后，于冰上解剖分离出肝胰脏，用4 ℃的生理盐水冲洗，用吸水纸将水吸干，准确称取组织重量，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成10%的组织匀浆，4 ℃、2 500 r/min离心10 min，取上清液用于酶活测定。组织匀浆粗提液蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行。

    1.5统计分析

     结果显示为平均值 ± 标准差（Mean ± SD），利用SPSS19.0对试验结果进行单因素方差分析（One-way ANOVA）， P<0.05确认为差异性显著。

    2结果

    2.1乳酸菌对东风螺生长性能和肌肉组成的影响

     乳酸菌对生长性能影响的结果见表2。经过70 d的试验养殖，方斑东风螺的增重率达到233%～246%，但与对照组相比，饲料中添加三个浓度乳酸菌对东风螺的增重率、特定生长率、肥满度、肉壳比、脏体比和存活率均没有显著影响（P>0.05）。如表3所示，饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分均没有显著影响（P>0.05）。

    表2饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺生长性能的影响

    乳酸菌浓度（CFU/100 g）01.2×1071.2×1081.2×109初始平均体重IBW/g0.64±0.010.62±0.000.62±0.010.62±0.01终末平均体重FBW/g2.15±0.042.06±0.102.11±0.052.14±0.06增重率WGR/%235.16±4.40ab232.81±14.77ab241.93±8.11ab246.30±7.39a特定生长率SGR/（%/d）1.73±0.03ab1.72±0.07ab1.76±0.04a1.78±0.03a肥满度CF0.38±0.03a0.35±0.02a0.34±0.04a0.39±0.05a肉壳比0.64±0.07a0.60±0.04a0.58±0.09a0.65±0.13a脏体比VSI/%8.31±0.68a8.76±0.71a7.87±1.20a8.99±2.00a存活率SR/%91.67±2.89a90.3±3.82a92.50±0.00a91.67±2.89a注：表中数据均为平均值±标准差。表中同一行上标不同小写字母表示组间差异性显著（P<0.05）。下表同。

    表3饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺肌肉组成的影响（%）

    乳酸菌浓度（CFU/100 g）01.2×1071.2×1081.2×109水分 Moisture72.64±0.95a73.29±0.52a72.37±0.87a72.60±0.85a粗蛋白 CP62.81±1.54a63.67±1.97a63.54±2.12a63.23±2.35a粗脂肪 CL21.88±2.92a22.29±2.29a22.89±2.82a22.04±3.60a灰分 Ash7.79±1.03a7.56±0.21a7.67±0.72a8.08±0.79a

    2.2乳酸菌对东风螺免疫功能的影响

     结果如表4所示，与对照组相比，饲料中添加浓度为1.2×107CFU/100 g的乳酸菌使东风螺肝胰腺SOD活力提高9.5%（P<0.05）;添加浓度为1.2×108和1.2×109CFU/100 g时，SOD活力分别下降了10.3%和19.0%（P<0.05）;饲料中添加乳酸菌对CAT和AKP活力没有显著影响（P>0.05）;添加浓度为1.2×109CFU/100 g时，ACP活力下降37.5%（P<0.05）。

    表4饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺免疫功能的影响

    乳酸菌浓度（CFU/100 g）01.2×1071.2×1081.2×109SOD（U/mg prot）74.82±4.39b81.91±1.46a67.09±0.48c60.57±0.92dCAT（U/mg prot）0.96±0.13a0.92±0.12a0.92±0.05a0.98±0.06aAKP（金氏单位/g prot）36.15±2.31a32.58±1.87a34.09±2.06a30.48±3.94aACP（金氏单位/g prot）27.92±1.62a31.36±1.21a26.43±1.67a17.45±0.60b

    3讨论

     乳酸菌是人和动物肠道非常重要的一类益生菌群，已被开发广泛应用于食品、医药、轻工业和畜牧业等领域。乳酸菌在肠道中定植后，通过自身的生长、繁殖及代谢改善宿主的胃肠道环境，抑制病原菌的生长，提高宿主的免疫功能，具有很好防病治病作用;另一方面，乳酸菌分泌乳酸、产生多种消化菌和营养物质，提高宿主消化吸收能力，促进生长[7-8]。乳酸菌是水产养殖中最为常用的微生态制剂之一，其在饲料中的添加效果因试验动物不同而有所差异。添加10%的乳酸菌组凡纳滨对虾的增重率和特定生长率分别较对照组提高7.13%和4.23%，饵料系数降低了8.38%[4]。乳酸菌添加量为106 CFU/g时，草鱼鱼种的增重率比对照组提高 26.47%[9]。饲料中分别添加8×105、4×106、2×107、1.5×108 CFU/g 的嗜酸乳酸菌，对吉富罗非鱼增重率、特定生长率等生长指标的影响不显著[5]。本研究中也发现饲料中添加乳酸菌对方斑东风螺的生长性能没有显著影响。不同的研究得出差异的结果，可能与试验动物肠道特点、乳酸菌菌种特性、菌对试验动物肠道以及养殖环境的适应性等有关。

     以往的研究均显示，饲料添加乳酸菌对水产动物体组成没有显著性影响，如吉富罗非鱼[5]和凡纳滨对虾[10]。本研究也得到一致的结果，乳酸菌对方斑东风螺肌肉可食用部分的组成没有显著影响。

    以往的研究显示乳酸菌及其代谢物对病原菌有较好的抑制作用。乳酸菌代谢物在酸性条件下对鳗弧菌的抑制效率在90%以上[11]，对副溶血弧菌有较强的抑制作用[12]。苟小兰等筛选了6株鱼源乳酸菌，对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌及豚鼠气单胞菌均有明显的抑制作用[13]。由于乳酸菌对某些病原菌有较好的抑制作用，其对水产动物免疫功能及防病抗病能力的影响受到较大的关注，研究表明饲料中添加乳酸菌可在一定程度改善凡纳滨对虾[4]、草鱼[9]、罗非鱼[2，5]、石斑鱼[6]、刺参[3]等的免疫功能和抗氧化活力，并提高水产动物的抗病能力[2，6，14]。在本研究中，测定了两种重要的抗氧化酶以及两种重要免疫相关酶的活力，结果显示SOD活力在最低浓度1.2×107CFU/100 g时有显著提高，乳酸菌浓度增加，SOD活力受到抑制;在最高浓度1.2×109CFU/100 g时，ACP活力也受到了抑制。表明本研究所使用的嗜酸乳酸菌菌种在低浓度时能一定程度上改善方斑东风螺抗氧化活力，随着乳酸菌浓度的增加，对抗氧化活力和免疫功能反而产生了不利影响。菌种对试验动物肠道以及养殖环境的适应性是影响该菌种应用效果的关键因素，显然并非同一菌种、菌株及菌浓度均能在所有水产动物物种上发挥较好的作用，使用不当可能造成反效果，今后的研究中应针对特定的水产动物筛选最为适宜的菌种菌株，并确定最佳添加范围，以便更为科学、规范地将益生菌应用到不同水产动物养殖上。

    参考文献：

    [1] 邝哲师，赵祥杰，叶明强，等.乳酸菌对水产养殖动物抗氧化应激与免疫力影响研究进展[J].畜牧与饲料科学，2011，32（8）：39-41

    [2] 黄燕华，周晓波，王国霞，等.5种乳酸菌对奥尼罗非鱼免疫和抗病力的影响[J].水产科学，2014，33（10）：601-605

    [3] 宫魁，王宝杰，刘梅，等.乳酸菌及其代谢产物对刺参幼体肠道菌群和非特异性免疫的影响[J].海洋科学，2013，37（7）：7-12

    [4] 王国霞，黄燕华，周晔，等.乳酸菌对凡纳滨对虾幼虾生长性能、消化酶活性和非特异性免疫的影响[J].动物营养学报，2010，22（1）：228-234

    [5] 刘小玲，曹俊明，邝哲师，等.嗜酸乳酸菌对吉富罗非鱼生长、非特异性免疫酶活性和肠道菌群的影响[J].广东农业科学，2013（1）：123-126

    [6] Son V M，Chang C C，Wu M C，等.Dietary administration of the probiotic，Lactobacillus plantarum，enhanced the growth，innate immune responses，and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides[J].Fish & Shellfish Immunology，2009，26（5）：691-698

    [7] 张家国，刘翠玲.乳酸菌代替抗生素在水产养殖上的应用[J].中国水产，2014（7）：66-68

    [8] 高鹏飞，张善亭，赵树平，等.乳酸菌在水产养殖业中的应用[J].家畜生态学报，2014，35（7）：82-86

    [9] 赵倩，赵凤梅，陈玉春，等.乳酸菌对草鱼鱼种生长指标及免疫指标的影响[J].畜牧与饲料，2012（12）：45-47

    [10] 王国霞，黄燕华，黄文庆，等.乳酸菌对南美白对虾生长、饲料利用和体组成的影响[J].中国饲料，2010（12）：24-32

    [11] 杨勇.乳酸菌及其代谢产物对鳗弧菌生长的抑制作用[J].中国水产，2006（10）：73-75

    [12] 窦晓明，孙高英，单虎.乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究[J].海洋科学，2007，31（8）：11-14

    [13] 苟小兰，苏艳秋，石锐，等.鱼源乳酸菌对水产病原菌的抑制作用研究[J].水产科学，2015，34（9）：575-579

    [14] 夏磊，范毛毛，杨仲明，等.复合乳酸菌对草鱼的安全性及肠炎病防治的试验效果[J].渔业信息与战略，2013，28（1）：44-49

    （下转第34页）《河北渔业》2016年第1期（总第265期）○研究与探讨