紫花苜蓿耐酸铝研究
熊军波++刘洋++蔡化++田宏++张鹤山
摘要：紫花苜蓿是全球栽培面积最大的多年生豆科牧草，铝毒是制约其在酸性土壤推广种植的主要因子之一。主要综述了紫花苜蓿铝毒害机理、抗铝品种选育、抗铝生理生化、抗铝的分子机理以及抗铝的转基因研究等方面的主要进展，并对紫花苜蓿耐铝性研究中存在的问题和前景进行了讨论。
关键词：紫花苜蓿；铝毒；品种选育；抗性基因
中图分类号：S54 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）11-0079-05
紫花苜蓿（Medicago sativ L.）是全球栽培面积最大的多年生豆科牧草，具有高产优质等特性，是公认的“牧草之王”。紫花苜蓿适宜生长在 pH 6.7～7.5的土壤环境中，当土壤pH低于6.7时，苜蓿产量会随着pH的下降而迅速下降[1]。据统计，世界范围内有超过40%的可耕作土地呈酸性[2]。我国长江以南广泛地分布着大面积的酸性土壤， 主要集中在浙江、江西、福建、广东、广西、海南、云南和贵州等南方省份， 总面积达2.04亿hm2，约占全国耕地面积的21%[3]。如何提高紫花苜蓿在酸性土壤中的产量，一直是国内外苜蓿工作者关注的重点。2001年美国农业部已将耐酸性苜蓿研究列为科研课题，我国也有相关项目已启动。
酸性土壤中作物减产主要由铝毒造成。近年来，国内外围绕紫花苜蓿抗铝毒进行了大量研究，主要集中在铝毒害机理、紫花苜蓿耐铝品种选育、耐铝性生理生化、耐铝分子机理及耐酸铝转基因研究等方面。笔者围绕这几方面对紫花苜蓿耐铝毒特性研究进展进行了综述，旨在为今后的研究工作提供参考。
1 铝的毒害机理
铝是地球上含量最高的金属元素，在中性或碱性土壤溶液中，铝主要以不溶性的硅酸盐和氧化物形式存在，对植物生长无危害；但当土壤环境呈酸性时，铝以离子态[Al（OH）2+、Al（OH）2+、Al3+、 Al（H20）63+]释放到溶液中[4]。一方面，酸性土壤中铝离子溶出占土壤中阳离子交换总量的20%～80%，导致其他土壤阳离子的吸附或流失， 造成钾、磷、钙和钼等营养元素的缺乏；另一方面，铝离子对植物生长产生毒害作用。研究表明，酸性土壤中作物减产67%是由铝毒造成[5]。
紫花苜蓿属铝毒极端敏感植物，高于0.1mmol/L的铝离子处理能明显降低苜蓿种子的发芽数量、速度和质量，抑制幼苗生长，其可能机制是A13+处理影响苜蓿种子萌发时主要贮藏物质蛋白质的转化、根细胞膜的选择透过性和叶片的光合作用[6]。根系吸收到铝离子在体内移动很小，主要分布在老根中，通过间接作用抑制新根系生长，导致次生根畸形分支、肿胀和数量减少，降低了水分和营养元素的吸收[7]。此外，铝离子通过影响根瘤菌和苜蓿相互识别过程中结瘤信号——结瘤因子的传递，导致根瘤生成减少，对根瘤菌固氮产生影响，从而使苜蓿的产量下降[8]。
农业生产中采用施生石灰对酸性土壤进行改良效果显著，但是该方法的成本较高，且改善的土壤主要集中在地表，土层深处的土壤依然是酸性，改良的效果有限。此外也有研究表明，钙、磷对紫花苜蓿根瘤菌体系酸铝胁迫有一定修复效应，但长期施用化肥会影响土壤团粒结构，导致板结。因此，在采用各种外源措施提高酸性土壤中苜蓿产量的同时，还须考虑紫花苜蓿自身的因素，充分挖掘其潜力，通过遗传改良来获得抗铝毒能力强的品种，这是持续、高效解决酸性土壤中铝毒害的有效途径。
2 紫花苜蓿耐酸铝鉴定和品种选育
对种质资源开展抗性鉴定是遗传改良和品种选育的基础，国内外研究者采用不同鉴定体系对紫花苜蓿种质资源抗铝性展开了鉴定。Bouton [9]采用水培法对美国农业部192 份核心紫花苜蓿种质进行了耐铝性鉴定，比较铝胁迫下根系的伸长率，发现4%的苜蓿种质根相对生长量显著高于GA-AT， 35%则显著低于GA-AT。李海庆等[10]对国内外79份苜蓿种质进行了耐铝鉴定，结果表明这些种质在铝胁迫下根相对生长量减少69.6%～3.2%不等。邱晓等[11]对27个紫花苜蓿品种耐铝性进行了评价，根据测定，将这些品种分为了四类。Pan等[12]对13个紫花苜蓿品种耐铝性进行了鉴定，结果表明铝胁迫下，13品种在相对根长，相对发芽率，相对下胚轴长度，相对鲜重和生根性等方面都存在差异性。此外，还有大量针对小批量苜蓿筛选的报道，结果都证实了苜蓿的耐铝性存在遗传多样性。
紫花苜蓿种质在抗铝性上存在显著的遗传多样性，且紫花苜蓿耐铝遗传性表现为一般配合力[13， 14]。因此，理论上通过多世代表型轮回选择可以选育抗铝毒性状好的品种。采用传统的轮回选择法，美国乔治亚大学的Bouton 团队培育出了目前公认最耐铝毒的苜蓿品种GA-AT，其抗铝毒能力显著高于美国农业部（U.S. Department of Agriculture，USDA）种子资源库收集的所有紫花苜蓿核心种质资源[9]。但这一品种并没有得到大面积推广，其主要原因是经济效益远落后于采用施生石灰后种植紫花苜蓿所获得的收益。这表明，传统的表型轮回选择法在提高紫花苜蓿抗铝性方面效果不显著。一方面，紫花苜蓿种质资源中缺乏抗铝毒性状突出的种质；另一方面，紫花苜蓿栽培种属于四倍体植物，其杂交优势和自交退化可能掩盖了抗铝基因的表达，导致种质分子遗传水平的异质性和表型间缺乏对应关系，致使特异抗铝性状难以通过表型选择实现。也有学者尝试采用组织培养筛选耐铝突变单细胞来提高紫花苜蓿的抗铝性，最终也未能取得突变，其主要原因是组织培养过程中出现的突变是随机的，且单细胞再生植株的抗铝性与单细胞的抗铝性关联不强[15， 16]。
3 紫花苜蓿耐酸铝分子机理
3.1 抗铝分子标记
从生理研究和遗传分析中得出的多数结果都表明紫花苜蓿耐铝毒性状是受多个基因控制的数量性状。随着分子标记技术的成熟和应用，对紫花苜蓿耐铝毒进行数量性状基因座（Quantitative trait locus，QTL）的定位和分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）成为可能。 Sledge等[17，18]以野生型二倍体苜蓿（M.sativa ssp.coerulea coerulea）与四倍体紫花苜蓿（M.sativa ssp）杂交群体为材料，采用限制性内切酶多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）标记技术，对紫花苜蓿耐铝性状进行了QTL定位研究。研究中共选取了146个探针对亲本进行筛选，其中58个作图探针定位于9个连锁群，且有9个表现为非连锁的独立遗传。最终发现4个标记（UGAC141、UGAC782、UGAC053、UGAC44）与耐铝性有关，其中UGAC44影响最大，占耐铝性变异影响参数的15%；随后又利用分子标记定位M.sativa ssp.Coerulea F2代与耐铝相关的QTLs，发现两个与耐铝相关的RFLP标记（UGAc471和UGAc502）。Narasmhamoorthy等[19]用M.sativa ssp.Coerulea为材料，使用SSR标记鉴定了抗铝数量性状位点QTLs，发现了3个区域与耐铝胁迫相关，分别在1号，2号和3号染色体上[19]。Khu等以Altet-4（耐铝基因型） 和NECS-141（铝敏基因型）两个紫花苜蓿杂交群体为材料，选用SSR标记进行分析，将耐铝基因定位于1，4，7三个连锁群，其分别可以解释20.8%，15.2% 和21.7%的变异。整体来说，目前的研究定位精度不够，定位的QTL的值信区域过大，无法确定检测到的一个QTL中是否包含有一个效应加大的基因还是几个微效基因。其主要原因是栽培紫花苜蓿为同源四倍体，基因组复杂，导致种质材料分子遗传水平的异质性和表型间缺乏明确对应关系。
3.2 抗铝基因研究
植物抗铝毒调节涉及到一个以上的基因，这些基因作为一个统一的整体进行调节，并可按照一定的时间顺序组成基因表达通路或基因调节网络，利用高通量分析技术从基因组学水平进行分析，可以帮助绘制相关基因作用通路或网图，发掘特异性表达基因。采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive hybridization，SSH）技术，国内研究者建立了紫花苜蓿响应铝胁迫的差异表达基因库，获取了一批铝诱导差异表达基因。夏卓盛等[21]以抗铝毒性较强苜蓿种质为材料构建了铝胁迫SSH文库，获取了34个与铝胁迫相关的EST 序列，25个EST与GenBank中其他序列具有同源性，9个EST未找到相似性较高序列。这些蛋白涉及到植物体的抗氧化作用、信号传导、发育和能量代谢等多种生理过程。樊奇等[22]以中苜一号幼苗为材料，构建了紫花苜蓿铝胁迫抑制消减文库，其中包含456个克隆，随机选取20个阳性克隆测序，共获得15条有效EST序列和3条未知基因序列。这些都能为潜在的耐铝基因源克隆和利用提供了基础。
紫花苜蓿近亲-蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）因具有生长期短、二倍体、基因组小、遗传转化效率高、自花授粉、固氮等特点，是世界公认的研究豆科生物学和基因组学的理想模式植物[23，24]。Chandran等[25]采用基因芯片技术研究敏铝型蒺藜苜蓿Jemalong A17铝胁迫下转录组的变化。结果表明，有2 782个基因表达量发生变化，其中591个表达量发生两倍以上变化。对这些基因的功能分析表明，表达上调的基因大多与细胞壁修饰、生物和非生物胁迫应激相关，而表达量下调的基因大多与初生代谢、次生代谢以及蛋白质生物合成和折叠相关。值得关注的是研究中发现部分新基因，这些基因与细胞壁修饰、乙烯合成、有机酸转运、维持钙动态平衡相关。后续利用RNAi技术对基因功能进行验证，发现一个参与果胶修饰基因，其低水平表达能显著减少A1吸附到苜蓿毛状根。由于研究中仅选用了一种蒺藜苜蓿材料，很难区分哪些基因是特定的受铝诱导基因，因为本研究获取的大部分基因也受其他条件的诱导，如：其他金属毒害、钙缺乏、受伤以及病虫害侵袭等。此后，Chandran等采用基因芯片比较了两份耐酸铝能力存在差异的蒺藜苜蓿材料在响应铝胁迫过程中转录组的差异表达，结果表明，抗铝性和敏铝性材料在转录组的差异主要体现在抗氧化胁迫的基因表达方面，抗性材料有更多抗氧化胁迫基因表达量上升，这有助于减少由吸收铝离子而引起的氧化伤害。结果还表明在铝诱导下两种材料中MtMATE基因表达量都急剧上升，但在铝敏型种质中主要在韧皮部表达，而抗铝型种质中则主要在导管中表达。MATE基因属于多药和有毒化合物排出跨膜蛋白家族（Multidrug and toxic compound exudation ，MATE）成员，受铝诱导激活，通过特异地往细胞以外转运柠檬酸，螯合细胞外的铝离子而发挥抗铝毒作用，进而推测耐铝型苜蓿通过将柠檬酸-铝的结合体转运到地上部分以减少铝对根系的毒害，而敏铝型则通过分泌柠檬酸来降低铝离子毒害[26]。Chen等[27]利用高通量测序技术筛选酸铝诱导miRNA，获取了23个铝诱miRNAs，对这些miRNA表达模式分析表明，大部分miRNA在短时间胁迫后就迅速表达，功能分析表明，这些miRNA调控的RNA主要与根的伸长，抗胁迫蛋白的合成等相关。姜格格等[28]采用全基因组关联分析方法，筛选出58个与蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的SNP标记，这些SNP位点主要参与细胞壁合成、脂质代谢、环境胁迫响应过程、氧化还原反应过程以及小分子转运等过程。Campbell等在比较两个铝敏性不同的紫花苜蓿根响应铝胁迫的蛋白组研究时发现，耐铝型苜蓿品种产生一个18.7kD蛋白质条带，而铝敏品种却没有，当时的分离技术手段和鉴定技术都较为落后，后续研究未能继续展开[29]。
3.3 抗铝基因工程研究
利用重组DNA技术和植物细胞全能性相结合，在体外操作基因，将外源基因转入植物细胞，再生出转基因植株，从而开创了遗传改良的新途径。近年来越来越多的研究结果已经表明，诱导根系合成和分泌有机酸是一些耐铝种或品种抵御铝毒的主要机制，有机酸合成和分泌调控基因的研究成为了抗铝研究的重点。Langer等[30]研究发现，铝胁迫下紫花苜蓿根系柠檬酸和琥珀酸分泌显著增加，其分泌量与铝离子浓度成正相关。目前紫花苜蓿中部分与有机酸合成和分泌相关的基因成功克隆。Miller等[31]从紫花苜蓿乙醛酸循环体、叶绿体、细胞质体、线粒体和根瘤体中克隆出5个苹果酸脱氢酶（Malate dehydrognase，MDH） 同工酶基因，其中根瘤体的MDH（Nodule-enhanced Malate dehydrognase，neMDH） 基因表达量和蛋白活性最高。乌艳红等从紫花苜蓿中克隆了铝激活苹果酸转运蛋白基因（Aluminum-activated malate transporter protein，MsALMT1），该基因参与苹果酸的跨膜转运[32]。靳苗苗等克隆了柠檬酸合成关键酶-柠檬酸合酶基因（Citrate synthase，MsCS）。Chandran等[26]从蒺藜苜蓿中克隆获得柠檬酸转运相关的通道蛋白基因（Multidrug and toxic compound exudation ，MtMATE）。
1986年，Deak等首次采用根癌农杆菌介导的方法获得了转基因苜蓿，为紫花苜蓿转基因研究奠定了基础。通过转基因技术手段提高抗铝性也成为国内外研究的重点。Fuente等1997 首次采用转基因手段将细菌（Pseudomonas aeruginosa）的柠檬酸合成酶基因在烟草‘Xanthi体内过量表达，结果植株抗铝能力得到提高。这表明，通过调控有机酸合成基因的表达可能是调控抗铝性的重要途径。Barone等[34]将绿脓杆菌中克隆的柠檬酸合酶转入苜蓿诱导超表达，显著提高了苜蓿根在酸铝条件下的生长性。Tesfaye等[35]和罗小英等[36]将根瘤增强苹果酸脱氢酶基因转入苜蓿诱导超表达，显著提高了苜蓿根在酸铝条件下的生长性。刘嘉等证明将源于大肠杆菌的光诱导型苹果酸脱氢酶基因转入紫花苜蓿能一定程度提高苜蓿耐铝性。
这些研究证实了转基因苜蓿的根能更好的生长在含铝的酸性土壤中，但目前所获得的转基因苜蓿在综合提高抗铝毒性能力方面非常有限。目前对紫花苜蓿抗铝毒分子机理的了解非常有限，转基因主要是通过改变苜蓿体内有机酸代谢和分泌的相关酶类的活性来创造转基因植株，但植物存在多种抗铝机制，不同植物种类或同一植物的不同品种在抗铝机制上都存在差异，且有机酸的分泌只是其中一种。在大豆（Glycine max），玉米（Zea mays）及荞麦（Fagopyrum esculentum）上的研究表明，有机酸分泌并不是种内抗铝性差异的主要机制[38-40]。Howard等[30]研究也发现有机酸的分泌差异并不能完全解释不同紫花苜蓿在耐铝性上存在的差异。Tesfaye等[41]发现耐铝性紫花苜蓿GA–AT和转neMDH基因紫花苜蓿在耐铝能力上相似，但是在有机酸的合成和分泌模式上却存在显著差异。Chandran等[26]对不同铝敏型蒺藜苜蓿进行生理研究发现，耐铝型种质铝积累的根表皮细胞降解的速度要快于敏感型材料，表明耐铝性与根表皮细胞的降解相关。因此，要通过转基因手段提高紫花苜蓿抗铝性还必须建立明确其抗铝分子机制的基础上，探索更有效的工具基因。
4 结语
紫花苜蓿作为全球最重要的优良豆科牧草，对畜牧业的发展以及生态环境的改善起着重要作用，但抗酸铝能力差限制了其在我国南方的种植，提高紫花苜蓿在酸铝性土壤中产量是苜蓿研究者需解决的问题。通过工程手段中和土壤酸性是目前最有效的方法，但是从长远的角度考虑还须充分挖掘紫花苜蓿自身潜力，通过遗传改良来获得抗铝毒能力强的品种。紫花苜蓿种质资源在抗酸铝性上存在差异性，但是缺乏特异性抗酸铝能力强的材料，且异花授粉的同源四倍体特性，导致传统的杂交育种进展缓慢。通过基因工程技术改良苜蓿抗酸铝性已在国内外展开，在一定程度上提高了紫花苜蓿抗铝性，但这些研究都是处于探索阶段，离最终获得抗逆高产的目标还有差距。由于植物的耐铝性是一个受多基因控制的数量性状，目前的研究多少基于单基因的转化，这可能是限制基因工程耐铝育种发展的原因之一。此外，人们对紫花苜蓿的抗酸铝调节机制仍不完全清楚，这正是限制获得耐铝性强的新品种的主要障碍。
近年来，各种模式植物基因组测序相继完成，大量基因功能得到阐明，这为利用模式物种信息进行栽培作物的改良奠定了良好的基础。紫花苜蓿近亲-蒺藜苜蓿是世界公认的研究豆科生物学和基因组学的理想模式植物[23， 24]。目前蒺藜苜蓿全基因组测序工作已进入尾声，94%基因测序已完成，且大量基因的注释工作也以完成，这为各种高通量功能基因组学技术研究奠定了坚实基础[42]。比较基因组学研究证实，蒺藜苜蓿与紫花苜蓿有保守性非常高的共线性关系，因此从蒺藜苜蓿获取的重要抗性基因资源既可以直接用于提高紫花苜蓿的抗逆性，也可以通过同源克隆的方法从紫花苜蓿中获得同源基因[43]。研究证实，蒺藜苜蓿种质资源在抗铝性上存在遗传多样性[44]。因此，在研究紫花苜蓿抗酸铝机制中可以充分利用近亲-蒺藜苜蓿模式植物的优势，从模式植物入手，可以克服紫花苜蓿基研究的一些缺点，这为全面研究并了解紫花苜蓿的耐铝相关代谢途径以及发掘耐铝相关基因和其表达模式提供了新的途径。
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