牡蛎多糖苹果果醋的制备及其抗氧化活性研究

    蔡成呈++李欣遥++佟长青++李伟

    摘 要：以苹果醋为主要原料，添加牡蛎多糖采用正交实验研制牡蛎多糖苹果果醋，并测定了牡蛎多糖苹果果醋、牡蛎多糖及苹果醋的ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和还原能力。结果表明，牡蛎多糖苹果果醋的最佳配方为：牡蛎多糖添加量0.3%，酵母添加量0.1%，柠檬酸添加量0.1%，蜂蜜添加量10%，其感官评定得分为86.6。抗氧化测定结果表明，牡蛎多糖苹果果醋ABTS自由基清除率为95.81%，DPPH自由基清除率为95.11%，还原力为0.66，具有较强的抗氧化活性。

    关键词：牡蛎多糖；苹果醋；正交实验；抗氧化活性

    牡蛎（Oyster）是我国四大养殖贝类之一。牡蛎中含有多种生物活性物质，具有调节机体免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖、降血脂等生物活性[1]。滕瑜等用牡蛎多糖对四氧嘧啶诱导的高血糖大鼠进行降血糖的研究，发现牡蛎多糖提取物可降低血糖、尿糖，改善临床症状[2]。于娅等采用酶解方法制备了牡蛎短肽，HPLC法定量马尿酸测定ACE抑制活性，结果表明，0.4 mg/mL的牡蛎短肽的ACE抑制率为51.4%[3]。刘塞等发现牡蛎提取物能够显著降低高血脂鹌鹑的血浆总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白B的水平，从而起到降血脂作用[4]。Shi等发现牡蛎多糖对CCl4诱导的小鼠化学性肝损伤具有保护作用[5]。

    果醋被誉为第四代饮料，它不但具有醋原有的功能，还具有保健功能[6]。由于其具有浓郁的香味，果酸含量较为丰富，所以其风味和口感都比食醋要好[7]。据国内外研究发现，果醋对人体具有良好的功效。它具有调节人体新陈代谢、降低胆固醇的含量、加快酒精在人体内的分解代谢、健胃消食等作用，因此是公认的集多种疗效于一身的健康饮品[8-14]。目前，尚未见到牡蛎多糖苹果果醋的报道。本研究将牡蛎多糖添加到果醋中，研制出牡蛎多糖苹果果醋。它不仅具有浓郁的果香及酸甜的口感，而且具有较好的抗氧化活性，是一种理想的保健饮品。

    1 材料与方法

    1.1 材料与仪器

    苹果醋饮料 河南郑新天源食品有限公司；杂花蜂蜜 大连蜂产品有限公司；高活性干酵母 安琪酵母有限公司；牡蛎多糖（CGPS-1） 实验室自制；DPPH（2，2-联苯基-1-苦基肼基）、ABTS（2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐） 美国Sigma 公司；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸及无水乙醇 大连沅义科技有限公司。

    BS110S分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；IEC微量台式小型离心机 德国Thermo公司；UV-754紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

    1.2 实验方法

    1.2.1 牡蛎多糖苹果果醋的制备 牡蛎多糖苹果果醋的加工工艺如下：牡蛎多糖与酵母加水混合均匀，30 ℃发酵30 min；然后加入一定量的柠檬酸、蜂蜜及苹果醋调味，8 000 r/min离心10 min使调制的果醋澄清，制得牡蛎多糖苹果果醋。

    1.2.2 感官评定 经培训、考核、再培训选出十位感官评定员，对牡蛎多糖苹果果醋外观、风味及口感进行评分，三项评分的和即为最后得分，并进行方差分析，评分标准如表1所示。

    1.2.3 单因素实验 以感官评分表为标准，考察牡蛎多糖、酵母、柠檬酸、蜂蜜的添加量对牡蛎多糖苹果果醋外观、风味及口感的影响。设定多糖添加量为0.3%，酵母添加量为0.25%，柠檬酸添加量为0.1%，蜂蜜添加量为10%，其他条件不变，依次改变单因素含量进行单因素实验。多糖添加量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；酵母、柠檬酸添加量为0.1%、0.25%、0.4%、055%、0.7%；蜂蜜添加量为2%、4%、6%、8%、10%。

    1.2.4 正交实验 通过单因素的实验结果，确定牡蛎多糖、酵母、柠檬酸、蜂蜜的添加量，进行4因素3水平正交实验，因素水平表如表2所示。

    1.2.5 果醋理化指标的测定 总酸（以乙酸计）含量按照国标《食品中总酸的测定》（GB/T 12456-2008）规定的方法进行测定。苹果酸含量参照国标《食品中有机酸的测定》（GB/T 5009.157-2003）规定的方法进行测定。乳酸含量参照行标《进出口果汁中乳酸、柠檬酸、富马酸含量检测方法 高效液相色谱法》（SN/T 2007-2007）规定的方法进行测定。通过pH计、糖度计对牡蛎多糖苹果果醋pH、糖度含量进行检测。

    1.2.6 ABTS自由基清除能力测定 ABTS法测定的为物质的总抗氧化能力，参照文献[15]并略微改动。将7.4 mmol/L的ABTS溶液与2.6 mmol/L的K2S2O8混合，黑暗室温下放置12 h制得ABTS自由基溶液。用95%乙醇将ABTS自由基溶液稀释至734 nm处吸光度值为0.7±0.01。将2 mL稀释后的ABTS自由基溶液加入到0.9 mL不同浓度的样液中，25 ℃水浴6 min，734 nm测定吸光度为Ai。相同条件下测定不同浓度的0.9 mL样液溶液与2 mL 95%乙醇的吸光度值为Aj；2 mL ABTS+与0.9 mL蒸馏水的吸光度值为Ao。

    ABTS自由基清除率（%）=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

    式中：Ao为空白对照的吸光度值； Ai为样液的吸光度值； Aj为本底的吸光度值。

    1.2.7 DPPH自由基清除能力测定 DPPH可作为典型的体外抗氧化活性评价标准，参照文献[16]测定牡蛎多糖苹果果醋对DPPH自由基清除能力。将不同浓度的2 mL样液溶液与2 mL DPPH（0.2 mmol/L）溶液混合均匀，于室温避光反应30 min后，于517 nm处测定吸光度为Ai。相同条件下测定不同浓度的2 mL样液溶液与2 mL 95%乙醇的吸光度值为Aj；2 mL DPPH·与2 mL蒸馏水的吸光度值为Ao。

    DPPH自由基清除率（%）=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

    式中：Ao空白对照的吸光度值；Ai样液的吸光度值；Aj本底的吸光度值。

    1.2.8 还原力的测定 参照文献[17]方法且略有改动。取不同浓度的样液0.5 mL，依次加入0.2 mol/L pH为6.6的磷酸缓冲液1.25 mL，1 g/100 mL的铁氰化钾溶液1.25 mL。充分混合均匀后，50 ℃恒温水浴20 min，取出冷却后，加入10 g/100 mL的三氯乙酸溶液1.25 mL，并于8 000 r/min的条件下离心10 min。移取1.25 mL上清液，加入1.25 mL蒸馏水及0.1 g/100 mL的三氯化铁溶液0.5 mL，混匀后于700 nm处测定吸光度。

    1.3 数据处理

    所有实验数据通过spss 19.0统计学软件进行计算，结果均以平均值±标准方差表示。

    2 结果与分析

    2.1 牡蛎多糖苹果果醋制备

    由图1可知，随着牡蛎多糖添加量的增加，得分先升高后下降，在0.2%～0.4%时得分较高，0.3%时得分达到最大值。因牡蛎多糖具有腥味，添加量过大时会使牡蛎多糖苹果果醋口感不协调，而添加量过低会影响其生物活性，因此选择添加量为0.2%～0.4%。

    由图2可知，酵母添加量为0.25%时得分最高为71.5。继续增加酵母添加量后，得分不断下降。原因是酵母本身具有特殊风味，其添加量越大，对牡蛎多糖苹果果醋口感及风味影响越大。

    由图3可知，随着柠檬酸添加量增加，得分下降，添加量为0.1%时得分最高。添加柠檬酸可掩盖牡蛎多糖的腥味，起到调节口感的作用，但苹果醋本身酸味较浓，柠檬酸添加量过高会使苹果醋偏酸，让人无法接受。

    由图4可知，蜂蜜添加量越大，得分越高，添加量为10%时，得分达到最大值。如果蜂蜜添加量继续增大，就会使制得的果醋液体浑浊，严重影响其外观及口感。

    通过单因素实验结果确定牡蛎多糖添加量为0.2%、0.3%、0.4%；酵母及柠檬酸添加量为0.1%、0.25%、0.4%；蜂蜜添加量为6%、8%、10%，并以此设计正交实验，结果如表3所示。

    根据表3可知，影响牡蛎多糖苹果果醋感官品质的顺序为B>A>D>C，即酵母>牡蛎多糖>蜂蜜>柠檬酸。其极差分析得最优组合为A2B1C1D3，即牡蛎多糖添加量为0.3%，酵母添加量为0.1%，柠檬酸添加量为0.1%，蜂蜜添加量为10%。

    通过正交实验得出了最优组合并做了验证试验，此组合最终得分为86.6。因此确定牡蛎多糖苹果果醋的最佳配方为多糖含量为0.3%、酵母0.1%、柠檬酸0.1%、蜂蜜10%。蒋杨等在研制近江牡蛎多糖口服液中采用活性炭滤纸脱腥法、酵母脱腥法和β-环糊精包埋法三种方法进行脱腥。相比之下，酵母脱腥法具有操作简单，成本低廉等特点[18]。本实验添加酵母去除牡蛎多糖的腥味，柠檬酸及蜂蜜可使果醋口感协调，因此制备的牡蛎多糖苹果果醋口感清爽、风味独特、色泽金黄。

    2.2 牡蛎多糖苹果果醋理化指标

    牡蛎多糖苹果果醋的理化指标测定结果如表4。牡蛎多糖苹果果醋的pH为2.69，糖度为9%，苹果酸含量为560.5 mg/kg以及乳酸含量为17.79 mg/kg。有文献报道果醋中总酸含量为4.6 g/kg、pH为3.0[19]，糖度为13.2%[20]。

    2.2 牡蛎多糖苹果果醋抗氧化活性

    如图5所示，牡蛎多糖苹果果醋与苹果醋均具有较好的ABTS自由基清除能力且具有浓度依赖性。在浓度为0.51 mg/mL时，牡蛎多糖苹果果醋清除率为95.81%。本实验不再增加样本浓度是因为在0.51 mg/mL时，牡蛎多糖苹果果醋与苹果醋的自由基清除率几乎相同。

    如图6所示，牡蛎多糖苹果果醋展现出较强的DPPH自由基清除能力。随浓度的增加，清除能力增强，当浓度达到1.65 mg/mL后，清除率缓慢增加，本实验样本的最大浓度为1.95 mg/mL，此时清除率达到最大值为95.11%，均高于牡蛎多糖与苹果醋。原因可能是牡蛎多糖苹果果醋中一些其他具有生物活性的成分起到了协同增效的作用。

    图7为还原能力测定结果，牡蛎多糖苹果果醋的还原力与苹果醋、牡蛎多糖相比较强，且具有浓度依赖性。还原能力可以作为潜在抗氧化性能的重要体现，还原能力越强，抗氧化性越强。

    3 结论

    通过单因素及正交实验制备出的牡蛎多糖苹果果醋最佳配方为牡蛎多糖添加量为0.3%、酵母添加量为0.1%、柠檬酸添加量为0.1%及蜂蜜添加量为10%；制备出的牡蛎多糖苹果果醋具有色泽金黄、果香浓郁、口感柔和饱满、酸甜适中的特点。抗氧化活性研究表明，牡蛎多糖苹果果醋具有较强的抗氧化活性且高于牡蛎多糖及苹果醋。因此，牡蛎多糖苹果果醋不仅具有独特的风味，同时还具有较强的抗氧化活性，具有开发价值。

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