超声辅助提取结合高效液相色谱
曹玉嫔+闫丽珍+黄红丽+邓必阳
摘 要 用蛋白酶K和脂肪酶作为提取剂、用超声波辅助提取牛蒡和三七样品中的硒形态。建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定牛蒡和三七样品中硒代胱氨酸（SeCys2）、亚硒酸盐[Se]、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸盐[Se]的新方法。用8 mmol/L pH 5.0的柠檬酸作为流动相，在8 min内可分离4种硒形态。利用CH4作为DRC反应气体，可消除了40Ar40Ar+对80Se+的干扰，提高了准确度。SeCys2、Se、SeMet和Se的检出限分别为0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL，相关系数（R2）均大于0.9995，加标回收率范围为95.1%～114.6%，RSD<3%。将本方法应用于牛蒡和三七中硒形态分析，结果令人满意。
关键词 硒； 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱； 牛蒡； 三七； 超声提取
1 引 言
硒是人体必需微量元素之一[1，2]，具有清除体内自由基、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金属毒性等生物学功能[3]。许多疾病的发生与硒的摄入量偏低有关，硒的摄入量低于每日30 μg，就会出现衰老，易发心肌炎及其他疾病[4]；摄入量高于每日耐受上限400 μg，就会导致头发指甲易断、皮肤粗糙、肠胃功能紊乱、易怒以及神经功能障碍等[5]。体内硒的适宜浓度范围很窄[6]，其生物有效性以及毒性在很大程度上取决于硒的化学形态[1，7，8]。
目前，对硒形态分析常采用液相色谱（LC）[9，10]、气相色谱（GC）[11]、毛细管电泳（CE）[12] 等分离手段，采用电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS）[7，10]、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）[1]、原子吸收光谱（AAS）[13]及原子荧光光谱（AFS）[14]等检测手段。
牛蒡（Burdock）又名东洋参、牛鞭菜，为菊科牛蒡属二年生草本植物[15]。牛蒡是我国传统的药食同源植物，具有疏散分热、解毒消肿的功效。自从牛蒡子中分离得到牛蒡苷以来，牛蒡的食用和药用价值也越来越受到人们的重视。但牛蒡中硒形态分析尚未见报道。
三七是五加科人参属植物三七（Panax notoginseng）的根，是中国特有药用植物，产于我国的西南部的云南、广西、江西、四川、湖北等地，当地民间发掘使用源远流长[16]。三七是一种常年生中药，作为一种传统中草药已有超过600年的历史[17]。三七有多种药理学活性，常用于治疗心血管疾病、脑血管疾病、炎症、外伤和出血等[18～20]。目前已报道了三七中无机硒形态[21，22]，但三七中有机硒形态未见报道。
电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS） 法具有灵敏度高、线性范围宽、多元素多同位素同时检测、干扰少等优点。高效液相色谱 （HPLC） 具有多种不同的分离模式，强大的分离能力和重现性好等优点。HPLC与ICP-MS联用，在灵敏度、准确度和分析速度等方面表现出优势，而且接口相对简单，因此HPLC-ICP-MS广泛应用于元素形态分析。超声波辅助提取（USAE）具有提取速度快、提取效率高及操作简便等优点。本实验集中了USAE、HPLC及ICP-MS的优点，建立了USAE-HPLC-ICP-MS联用的新方法，并用于牛蒡和三七样品中硒形态分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
NexIon 300X 型ICP-MS仪器（美国PerkinElmer公司）配备一个动态反应池（Dynamic Reaction Cell， DRC）系统，样品溶液通过Meinhard玻璃雾化器和玻璃旋流雾室引入到ICP-MS；Flexar液相色谱仪（美国PerkinElmer公司）由Flexar Binary LC Pump和Flexar solvent manager组成，配备Flexar LC Autosampler；Hamilton PRP-X100分析柱（250 mm×4.1 mm， 10 μm， 瑞士Hamilton公司）， Hamilton PRP-X100 保护柱（20 mm×2.1 mm， 10 μm，瑞士Hamilton公司）；色谱柱与ICP-MS雾化器用PEEK管连接；Titan MPS微波消解仪（美国PerkinElmer公司）；SK3310HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；TG16-W微量高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DZF-300真空干燥箱（郑州长城科工贸有限公司）；Purelab Option超纯水系统（英国ELGA公司）。
硒标准溶液（GSB G62029-90（3401），1000 μg/mL，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院）；SeO2（AR，北京市朝阳区中联化工试剂厂）；Na2SeO4（AR，天津市化学试剂研究所）；硒代胱氨酸（SeCys2，纯度98%，北京百灵威公司）；硒代蛋氨酸（SeMet，纯度99%，美国Alfa公司）；脂肪酶（AR，北京索莱宝科技有限公司）；蛋白酶K（20 mg/mL，天根生化科技（北京）有限公司）； HNO3、H2O2 （超纯，苏州晶瑞化学有限公司）；甲烷（99.999%，大连大特气体有限公司）；柠檬酸、乙酸、氨水、磷酸二氢铵、甲酸（AR，西陇化工股份有限公司）。质谱调谐液（美国PerkinElmer公司）为Be， Mg， In， U， Ce浓度都为1 μg/L混合标准溶液。实验用水为超纯水。
2.2 实验方法
2.2.1 总硒的测定 牛蒡和三七样品均购于桂林市药店。将样品置于真空干燥箱中低温烘干，研细混合均匀，过100目筛。称取上述样品0.2000 g于消解罐中，加入6 mL HNO3和1 mL H2O2，按照表1微波消解程序进行消解。消解结束后，冷却，打开消解罐，样品溶液转移至25 mL容量瓶中，用超纯水洗涤3次，合并洗涤液，再用超纯水定容，摇匀备用。同样方法制备试剂空白溶液。按照表2中ICP-MS条件进行测定。
2.2.2 硒形态分析方法 称取牛蒡和三七样品各0.5000 g于10 mL离心管中，加入2 mL超纯水，1 mL 20 mg/mL蛋白酶K和10 mg脂肪酶，在超声频率为53 kHz和37℃水浴中超声处理1.5 h，然后以6000 r/min离心15 min，重复提取二次，将提取液合并，用水稀至10 mL，摇匀备用。同样方法制备试剂空白溶液。所有溶液测定前经0.45 μm水性滤膜过滤。按照表2操作条件，进行测定。
3 结果与讨论
3.1 流动相类型及浓度的选择
考虑到应尽量采用简单和无毒试剂作为流动相，本实验选择磷酸二氢铵和柠檬酸作为流动相进行考察分析。当NH4H2PO4作为流动相时，Se保留时间约30 min，并且SeMet信号强度较低。当用柠檬酸溶液作为流动相时，可实现4种硒形态在8 min内完全分离，且柠檬酸作为流动相时成分单一，配制简单，因此，本实验选择柠檬酸溶液作为流动相。
考察了柠檬酸浓度对4种硒形态保留时间的影响，如图1。随着柠檬酸浓度的增大，Se的保留时间逐渐减小，当柠檬酸浓度达到10 mmol/L时，SeMet的保留时间与Se的保留时间重叠，当柠檬酸浓度为8 mmol/L时，4种硒形态在8 min内均能良好分离。因此，本实验选择柠檬酸浓度为8 mmol/L。
3.2 柠檬酸酸度的影响
在确定了流动相的组成和浓度后，考察了不同酸度条件下柠檬酸对硒形态分离效果的影响。本实验采用20% NH3·H2O调节柠檬酸的酸度，在pH 4～6范围内，4种硒形态保留时间见图2。随着pH值增大，Se的保留时间逐渐减少。当pH=4时，Se的保留时间为14.33 min；当pH=6.0时，SeMet和Se已经重叠，只出现3个峰；当pH=5时，4种硒形态分离效果最佳。因此，本实验选择柠檬酸溶液的pH=5。
3.3 流动相流速对保留时间的影响
为了得到最佳的分离度，实验考察了流动相流速对硒形态保留时间的影响，图3 使用CH4（a）和O2（b）作为DRC气体时的色谱图
Fig.3 Chromatograms of selenium species using CH4（a） and O2（b） as dynamic veaction cell （DRC） gas
Concentrations of SeCys2， Se， SeMet and Se are 5 ng/mL each. The detection conditions are shown in Table 2 except CH4随着流动相流速的增大，4种硒形态的保留时间均逐渐缩短，当流动相流速达到1.7 mL/min时，SeCys2与Se分不开。综合考虑，本实验流动相的流速选择为1.5 mL/min。
3.4 动态反应池（DRC）条件的优化
硒在自然界中有6种同位素，80Se+的丰度最大，然而80Se+容易受到ArAr+的干扰，而ArAr+是ICP中常见的离子，因此本实验选择DRC技术消除干扰。本实验分别使用O2和CH4作为DRC反应气，考察其对于80Se+的干扰消除情况。当SeCys2， Se， SeMet和Se的浓度均为5 ng/mL 时，分别用O2和CH4作为DRC反应气时，混合标准溶液色谱图见图3。当O2作为DRC气体时，实验检测的是96SeO+，而96SeO+容易受到96Mo+的干扰，钼在植物中含量较高，因此难以完全消除干扰。当加入CH4作为DRC反应气时，CH4与40Ar40Ar+反应，消除了40Ar40Ar+对于80Se+的干扰。在植物硒形态分析中，甲烷消除干扰的能力及硒形态的峰强度均优于用O2作为DRC气体。因此，本实验选择CH4作为DRC反应气体。
3.5 ICP-MS检测条件的优化
RF功率、雾化气流速等工作参数是ICP-MS较重要的参数，这些参数对信号强度以及对氧化物和氢氧化物的形成有较大的影响。本实验采用PE公司提供的ICP-MS调谐溶液选定ICP-MS工作参数见表2。在最佳工作条件下得到的考察指标是： Be为4625 cps/（ng/mL）， Mg为44827 cps/（ng/mL），In为50930 cps/（ng/mL），U为41670 cps/（ng/mL），CeO+/Ce+为1.9%，Ce++/Ce+为0.9%。所有考察指标满足ICP-MS性能要求，因此所选条件符合实验要求。详细ICP-MS工作参数见表2。
3.6 分析性能
SeCys2， Se， SeMet和Se的检出限分别为0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL（n=6，3σ），线性范围分别为0.28～200 ng/mL，0.10～200 ng/mL，0.65～200 ng/mL和0.50～200 ng/mL，相对标准偏差（RSD，n=6）分别为3.2%， 2.5%， 3.5%和2.9%，相关系数R2>0.9995，用峰面积定量，其分析性能见表3。
3.7 提取剂的选择及样品分析
理想的预处理方法既能够有选择性地将各种含硒化合物从植物固态基体中高效提取出来，还要尽量避免在处理过程中对天然存在的各种含硒化合物造成损失，保证提取前后形态不会发生转变。根据文献报道，蛋白酶K和脂肪酶提取效果较好[23]，因此，本实验采用蛋白酶K-脂肪酶作为提取剂。为了便于比较，本实验也使用超纯水作为提取剂，考察提取效率。本实验利用超声波辅助酶提取需时1.5 h，而文献报道硒形态的提取时间为24 h[2]，因此本方法大大缩短了提取时间。分析结果见表4。
4 结 论
利用超声波辅助蛋白酶K-脂肪酶进行样品前处理，建立了HPLC-ICP-MS联用技术测定牛蒡和三七样品中SeCys2， Se， SeMet和Se的新方法。结果表明，本方法简便，快捷，在8 min内可将4种硒形态良好分离，方法重复性和精密度较好，可满足植物中硒形态分析的需要，为植物中硒形态分析提供了一种可行的分析方法。
References
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摘 要 用蛋白酶K和脂肪酶作为提取剂、用超声波辅助提取牛蒡和三七样品中的硒形态。建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定牛蒡和三七样品中硒代胱氨酸（SeCys2）、亚硒酸盐[Se]、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸盐[Se]的新方法。用8 mmol/L pH 5.0的柠檬酸作为流动相，在8 min内可分离4种硒形态。利用CH4作为DRC反应气体，可消除了40Ar40Ar+对80Se+的干扰，提高了准确度。SeCys2、Se、SeMet和Se的检出限分别为0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL，相关系数（R2）均大于0.9995，加标回收率范围为95.1%～114.6%，RSD<3%。将本方法应用于牛蒡和三七中硒形态分析，结果令人满意。
关键词 硒； 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱； 牛蒡； 三七； 超声提取
1 引 言
硒是人体必需微量元素之一[1，2]，具有清除体内自由基、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金属毒性等生物学功能[3]。许多疾病的发生与硒的摄入量偏低有关，硒的摄入量低于每日30 μg，就会出现衰老，易发心肌炎及其他疾病[4]；摄入量高于每日耐受上限400 μg，就会导致头发指甲易断、皮肤粗糙、肠胃功能紊乱、易怒以及神经功能障碍等[5]。体内硒的适宜浓度范围很窄[6]，其生物有效性以及毒性在很大程度上取决于硒的化学形态[1，7，8]。
目前，对硒形态分析常采用液相色谱（LC）[9，10]、气相色谱（GC）[11]、毛细管电泳（CE）[12] 等分离手段，采用电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS）[7，10]、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）[1]、原子吸收光谱（AAS）[13]及原子荧光光谱（AFS）[14]等检测手段。
牛蒡（Burdock）又名东洋参、牛鞭菜，为菊科牛蒡属二年生草本植物[15]。牛蒡是我国传统的药食同源植物，具有疏散分热、解毒消肿的功效。自从牛蒡子中分离得到牛蒡苷以来，牛蒡的食用和药用价值也越来越受到人们的重视。但牛蒡中硒形态分析尚未见报道。
三七是五加科人参属植物三七（Panax notoginseng）的根，是中国特有药用植物，产于我国的西南部的云南、广西、江西、四川、湖北等地，当地民间发掘使用源远流长[16]。三七是一种常年生中药，作为一种传统中草药已有超过600年的历史[17]。三七有多种药理学活性，常用于治疗心血管疾病、脑血管疾病、炎症、外伤和出血等[18～20]。目前已报道了三七中无机硒形态[21，22]，但三七中有机硒形态未见报道。
电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS） 法具有灵敏度高、线性范围宽、多元素多同位素同时检测、干扰少等优点。高效液相色谱 （HPLC） 具有多种不同的分离模式，强大的分离能力和重现性好等优点。HPLC与ICP-MS联用，在灵敏度、准确度和分析速度等方面表现出优势，而且接口相对简单，因此HPLC-ICP-MS广泛应用于元素形态分析。超声波辅助提取（USAE）具有提取速度快、提取效率高及操作简便等优点。本实验集中了USAE、HPLC及ICP-MS的优点，建立了USAE-HPLC-ICP-MS联用的新方法，并用于牛蒡和三七样品中硒形态分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
NexIon 300X 型ICP-MS仪器（美国PerkinElmer公司）配备一个动态反应池（Dynamic Reaction Cell， DRC）系统，样品溶液通过Meinhard玻璃雾化器和玻璃旋流雾室引入到ICP-MS；Flexar液相色谱仪（美国PerkinElmer公司）由Flexar Binary LC Pump和Flexar solvent manager组成，配备Flexar LC Autosampler；Hamilton PRP-X100分析柱（250 mm×4.1 mm， 10 μm， 瑞士Hamilton公司）， Hamilton PRP-X100 保护柱（20 mm×2.1 mm， 10 μm，瑞士Hamilton公司）；色谱柱与ICP-MS雾化器用PEEK管连接；Titan MPS微波消解仪（美国PerkinElmer公司）；SK3310HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；TG16-W微量高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DZF-300真空干燥箱（郑州长城科工贸有限公司）；Purelab Option超纯水系统（英国ELGA公司）。
硒标准溶液（GSB G62029-90（3401），1000 μg/mL，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院）；SeO2（AR，北京市朝阳区中联化工试剂厂）；Na2SeO4（AR，天津市化学试剂研究所）；硒代胱氨酸（SeCys2，纯度98%，北京百灵威公司）；硒代蛋氨酸（SeMet，纯度99%，美国Alfa公司）；脂肪酶（AR，北京索莱宝科技有限公司）；蛋白酶K（20 mg/mL，天根生化科技（北京）有限公司）； HNO3、H2O2 （超纯，苏州晶瑞化学有限公司）；甲烷（99.999%，大连大特气体有限公司）；柠檬酸、乙酸、氨水、磷酸二氢铵、甲酸（AR，西陇化工股份有限公司）。质谱调谐液（美国PerkinElmer公司）为Be， Mg， In， U， Ce浓度都为1 μg/L混合标准溶液。实验用水为超纯水。
2.2 实验方法
2.2.1 总硒的测定 牛蒡和三七样品均购于桂林市药店。将样品置于真空干燥箱中低温烘干，研细混合均匀，过100目筛。称取上述样品0.2000 g于消解罐中，加入6 mL HNO3和1 mL H2O2，按照表1微波消解程序进行消解。消解结束后，冷却，打开消解罐，样品溶液转移至25 mL容量瓶中，用超纯水洗涤3次，合并洗涤液，再用超纯水定容，摇匀备用。同样方法制备试剂空白溶液。按照表2中ICP-MS条件进行测定。
2.2.2 硒形态分析方法 称取牛蒡和三七样品各0.5000 g于10 mL离心管中，加入2 mL超纯水，1 mL 20 mg/mL蛋白酶K和10 mg脂肪酶，在超声频率为53 kHz和37℃水浴中超声处理1.5 h，然后以6000 r/min离心15 min，重复提取二次，将提取液合并，用水稀至10 mL，摇匀备用。同样方法制备试剂空白溶液。所有溶液测定前经0.45 μm水性滤膜过滤。按照表2操作条件，进行测定。
3 结果与讨论
3.1 流动相类型及浓度的选择
考虑到应尽量采用简单和无毒试剂作为流动相，本实验选择磷酸二氢铵和柠檬酸作为流动相进行考察分析。当NH4H2PO4作为流动相时，Se保留时间约30 min，并且SeMet信号强度较低。当用柠檬酸溶液作为流动相时，可实现4种硒形态在8 min内完全分离，且柠檬酸作为流动相时成分单一，配制简单，因此，本实验选择柠檬酸溶液作为流动相。
考察了柠檬酸浓度对4种硒形态保留时间的影响，如图1。随着柠檬酸浓度的增大，Se的保留时间逐渐减小，当柠檬酸浓度达到10 mmol/L时，SeMet的保留时间与Se的保留时间重叠，当柠檬酸浓度为8 mmol/L时，4种硒形态在8 min内均能良好分离。因此，本实验选择柠檬酸浓度为8 mmol/L。
3.2 柠檬酸酸度的影响
在确定了流动相的组成和浓度后，考察了不同酸度条件下柠檬酸对硒形态分离效果的影响。本实验采用20% NH3·H2O调节柠檬酸的酸度，在pH 4～6范围内，4种硒形态保留时间见图2。随着pH值增大，Se的保留时间逐渐减少。当pH=4时，Se的保留时间为14.33 min；当pH=6.0时，SeMet和Se已经重叠，只出现3个峰；当pH=5时，4种硒形态分离效果最佳。因此，本实验选择柠檬酸溶液的pH=5。
3.3 流动相流速对保留时间的影响
为了得到最佳的分离度，实验考察了流动相流速对硒形态保留时间的影响，图3 使用CH4（a）和O2（b）作为DRC气体时的色谱图
Fig.3 Chromatograms of selenium species using CH4（a） and O2（b） as dynamic veaction cell （DRC） gas
Concentrations of SeCys2， Se， SeMet and Se are 5 ng/mL each. The detection conditions are shown in Table 2 except CH4随着流动相流速的增大，4种硒形态的保留时间均逐渐缩短，当流动相流速达到1.7 mL/min时，SeCys2与Se分不开。综合考虑，本实验流动相的流速选择为1.5 mL/min。
3.4 动态反应池（DRC）条件的优化
硒在自然界中有6种同位素，80Se+的丰度最大，然而80Se+容易受到ArAr+的干扰，而ArAr+是ICP中常见的离子，因此本实验选择DRC技术消除干扰。本实验分别使用O2和CH4作为DRC反应气，考察其对于80Se+的干扰消除情况。当SeCys2， Se， SeMet和Se的浓度均为5 ng/mL 时，分别用O2和CH4作为DRC反应气时，混合标准溶液色谱图见图3。当O2作为DRC气体时，实验检测的是96SeO+，而96SeO+容易受到96Mo+的干扰，钼在植物中含量较高，因此难以完全消除干扰。当加入CH4作为DRC反应气时，CH4与40Ar40Ar+反应，消除了40Ar40Ar+对于80Se+的干扰。在植物硒形态分析中，甲烷消除干扰的能力及硒形态的峰强度均优于用O2作为DRC气体。因此，本实验选择CH4作为DRC反应气体。
3.5 ICP-MS检测条件的优化
RF功率、雾化气流速等工作参数是ICP-MS较重要的参数，这些参数对信号强度以及对氧化物和氢氧化物的形成有较大的影响。本实验采用PE公司提供的ICP-MS调谐溶液选定ICP-MS工作参数见表2。在最佳工作条件下得到的考察指标是： Be为4625 cps/（ng/mL）， Mg为44827 cps/（ng/mL），In为50930 cps/（ng/mL），U为41670 cps/（ng/mL），CeO+/Ce+为1.9%，Ce++/Ce+为0.9%。所有考察指标满足ICP-MS性能要求，因此所选条件符合实验要求。详细ICP-MS工作参数见表2。
3.6 分析性能
SeCys2， Se， SeMet和Se的检出限分别为0.088， 0.033， 0.30和0.17 ng/mL（n=6，3σ），线性范围分别为0.28～200 ng/mL，0.10～200 ng/mL，0.65～200 ng/mL和0.50～200 ng/mL，相对标准偏差（RSD，n=6）分别为3.2%， 2.5%， 3.5%和2.9%，相关系数R2>0.9995，用峰面积定量，其分析性能见表3。
3.7 提取剂的选择及样品分析
理想的预处理方法既能够有选择性地将各种含硒化合物从植物固态基体中高效提取出来，还要尽量避免在处理过程中对天然存在的各种含硒化合物造成损失，保证提取前后形态不会发生转变。根据文献报道，蛋白酶K和脂肪酶提取效果较好[23]，因此，本实验采用蛋白酶K-脂肪酶作为提取剂。为了便于比较，本实验也使用超纯水作为提取剂，考察提取效率。本实验利用超声波辅助酶提取需时1.5 h，而文献报道硒形态的提取时间为24 h[2]，因此本方法大大缩短了提取时间。分析结果见表4。
4 结 论
利用超声波辅助蛋白酶K-脂肪酶进行样品前处理，建立了HPLC-ICP-MS联用技术测定牛蒡和三七样品中SeCys2， Se， SeMet和Se的新方法。结果表明，本方法简便，快捷，在8 min内可将4种硒形态良好分离，方法重复性和精密度较好，可满足植物中硒形态分析的需要，为植物中硒形态分析提供了一种可行的分析方法。
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