二氢吡啶对中国荷斯坦牛HSP70表达的影响

    王学清+石少轻+吴占军+李魁英+倪俊卿+裴翠娟+张峰+王昆+马书林

    摘要：为研究二氢吡啶抗奶牛热应激的作用机理，以20头中国荷斯坦牛为材料，分别饲喂含0、100、150、200 mg/kg的二氢吡啶日粮，利用实时定量（qRT-PCR）技术对其外周血淋巴细胞HSP70基因mRNA的相对表达量进行检测。结果表明，日粮中添加二氢吡啶在高温热应激期可以显著提高中国荷斯坦牛HSP70的表达量，其中日粮中添加200 mg/kg组表达量最高，显著高于对照组和100 /mg/kg添加组（P<0.01）。

    关键词：HSP70基因； 二氢吡啶；实时定量RT-PCR

    中图分类号：S816.79 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）10-0021-03

    二氢吡啶（Diludin，2，6-二甲基-3，5-二乙基-1，4-二氢吡啶）是一种具有天然抗氧化剂维生素E的部分作用的新型多功能添加剂，具有抗氧化、提高血清SOD的活性、改变血清中激素水平等作用[1-5]。另外，孙燕燕等[6]通过二氢吡啶对小鼠热应激的影响研究表明，二氢吡啶在缓解小鼠热应激引起的生理损伤方面有一定的作用。张峰等[7]通过在奶牛日粮中添加二氢吡啶研究表明，二氢吡啶可以缓解夏季奶牛热应激对生产性能等指标造成的影响。

    奶牛热应激是指奶牛受到超过自身体温调节能力的过高温度刺激时，引起机体产生的非特异性应答反应，是导致奶牛夏季产奶性能、繁殖性能、免疫能力下降、造成奶牛死亡的主要原因之一[8-10]。热应激与一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质热应激蛋白（Heat shock protein，HSP）有关，该类蛋白最初在热处理果蝇中首次发现[11]。研究表明[7]HSPs在热耐受形成过程中维持细胞内环境的稳定具有重要作用[12]；Gabrief等[13]在对肉鸡的热应激中发现HSP70 mRNA表达量在35 ℃3 h达到最高值；有研究者在给处于热应激的大鼠口服中药制剂后发现添加中药制剂后可以调节应激大鼠后胃黏膜组织中的HSP70的表达[14]。

    因此，利用实时定量PCR技术研究不同温度条件下饲料中添加不同剂量二氢吡啶对奶牛血液中HSP70基因表达的影响，以初步探讨二氢吡啶抗热应激的作用机理。

    1 材料与方法

    1.1 试验材料

    选择处于相同胎次，相同泌乳阶段的健康奶牛20头，随机分为4组，每组5头。

    采样时间：根据日平均气温指数（THI）为85（高温期）、71.3（临界高温期）和58.2（适温期）时分别颈静脉采集全血10 mL于EDTA抗凝采血管中，置于冰盒中带回实验室。

    THI计算公式：THI=（1.8×Ta+32）-（0.55-0.55×RH）×（1.8×Ta-26） ，其中Ta为环境温度，RH为相对湿度[15]。

    1.2 饲喂方法

    预饲期：10～15 d，正饲期：3个月。

    饲喂：奶牛采取舍饲半拴系饲养，全混合日粮进行饲喂，将二氢吡啶与0.4 kg 精料补充料混匀后分3 次单独添加进行饲喂，每天喂料结束后散放到运动场自由运动，饮水槽保证足够清洁的饮水。试验期内固定专人负责奶牛饲喂、奶牛管理、采样并记录THI数据。

    各试验组二氢吡啶添加量：对照组、试验组1、试验组2、试验组3分别为0mg、100mg、150mg、200 mg/kg。

    1.3 主要试剂与仪器

    血液总RNA快速提取试剂盒；2×SYBR premix EXTaq TM；实时定量PCR仪。

    1.4 血液总RNA提取及反转录反应

    血液总RNA提取：采用上海生工血液总RNA快速提取试剂盒进行总RNA提取，提取后进行纯度检测。每个试验个体RNA单独反转录为cDNA。

    反转录反应体系为10 μL，其中总RNA 6.5uL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL、5×PrimeScript Buffer 2 μL、Random primers（引物）0.5μL、Oligo dT Primer（引物）0.5 μL。

    1.5 实时定量引物设计

    为避免基因组DNA污染干扰，根据跨内含子原则进行引物设计。设计合成HSP70引物序列为：上游5′- GGAAACCACCCGTTAGTGC - 3′；下游5′- CTGCCAATCCAACAACCTCTT- 3′。内参基因为β-Actin，引物序列为：上游5′- GTCACCAACTGGGAC GACA -3′；下游5'-AGGCGTACAGGTGACAGCA -3'，引物由上海生工合成。

    1.6 实时定量分析

    采用SYBR Green I荧光染料法进行实时定量RT-PCR扩增的检测。PCR反应体系为20 μL，其中2×SYBR premix EX TaqTM 10 μL、上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L）、cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。在实时定量PCR仪中同时进行HSP70和β-Actin的PCR反应，扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；61 ℃退火15s；72 ℃延伸10 s；45个循环后；72 ℃延伸10 min。反应过程中以高纯水替代cDNA作为阴性对照。

    HSP70 mRNA相对表达量采用2-ΔCT进行计算[16]，ΔCT= CTHSP70- CTβ-Actin。

    1.7 PCR扩增产物特异性检验

    通过分析熔解曲线和取5 μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳（100 v，15 min）确定扩增产物片段大小，进而确定PCR产物是否为目标片段。

    1.8 统计分析

    利用Prism 5软件进行单因子方差分析比较不同温度时期，同一处理组；相同温度时期，不同处理组组间的HSP70的相对表达丰度。

    2 结果与分析

    2.1 PCR产物特异性

    扩增曲线表明扩增效果良好，且R2≥0.98。经熔解曲线分析，HSP70（图1）和β-Actin（图2）分别在89 ℃和88.5 ℃出现单一产物峰，均与引物设计后预期产物Tm值相同。

    扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，HSP70 和β-Actin组均出现与目的片段大小吻合的片段，阴性对照无扩增条带。表明PCR产物分别为HSP70和β-Actin目的基因产物（图3）。

    图1 HSP70的扩增效率曲线

    图2 β-Actin的扩增效率曲线

    2.2 不同温度时期定量分析

    对照组、试验组HSP70表达量均随温度的升高而增加，其中试验组3在高温期表达量最高，4个分组在适温期HSP70的基因表达水平远低于高温期，说明HSP70基因在奶牛热应激过程中参与了其分子水平的调控（图4）。

    2.3 不同处理组间定量结果分析

    适温期、临界高温期HSP70基因表达水平在各组间差异不显著。高温期HSP70基因表达水平，试验组1、对照组与试验组3差异极显著（P<0.01），试验组2与对照组差异显著（P<0.05），其他各组间差异不显著（图4），说明在日粮中添加200 mg/kg二氢吡啶可以显著提高奶牛HSP70的表达量，从而缓解奶牛热应激反应。

    3 小结与讨论

    对于血液样品来说，存在起始材料数量、提取RNA效率、反转录效率、目的基因扩增效率不一致的情况，因此本研究选用实时荧光定量RT-PCR分析的相对定量方法，通过设定内参基因β-Actin校正差异，从而获得HSP70基因表达的相对变化。

    热应激蛋白按其分子量大小分为HSP110、HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPS及泛素，其中最重要的是HSP70[17]。研究发现HSP70与环境温湿度变化密切相关，在奶牛热耐受中起着主要作用[18，19]，大量研究表明，HSP70是机体接触高温或其他刺激时表达最强的一种热应激蛋白[20，21]。本试验表明，中国荷斯坦牛由适温期逐渐转向高温期的过程中，血液淋巴细胞均可表达HSP70，并且随着热应激程度的提高HSP70的表达量增加，这与Mosser DD等的研究结果一致[22，23]。同时本研究发现，在奶牛日粮中添加二氢吡啶，可以提高HSP70 mRNA水平的表达量，其中添加200 mg/kg日粮组提升效果最明显，这可能与二氢吡啶的抗氧化功能有关，可以与胞色素P-450结合形成复合体，从而抑制NADPH-细胞色素C还原酶的活性，隔断微粒体电子输送NADPH酶的活性，抑制脂类化合物的过氧化，清除自由基，对生物膜起到抗氧化和保护作用，同时提高生物膜中6-磷酸葡萄糖酶的活性，稳定生物细胞组织，促进动物新陈代谢[24，25]，从而提高HSP70的表达量，提高中国荷斯坦牛的抗热应激能力。

    本研究初步证明二氢吡啶对HSP70具有表达调控作用，为我们进一步开展二氢吡啶抗奶牛热应激机理奠定了基础。

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