规模化牛场致病性大肠杆菌的分离与鉴定

    杨克礼+李传友+郭锐+段正赢+田永祥

    摘要：湖北省某肉牛场2014年3～4月发生牛腹泻，无菌采集病牛腹泻物进行细菌分离培养，涂片、染色、镜检观察，并对其形态特征、培养特性、生化特性及致病性等生物学特性进行研究。结果表明引起该次疫病的病原是致病性大肠杆菌（E. coli）。

    关键词：牛；致病性大肠杆菌（E. coli）；分离；鉴定

    中图分类号：S852.61 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）10-0005-02

    大肠埃希氏菌（E. coli）通常称为大肠杆菌，由Escherich于1885年首次在动物的肠道内发现[1]。在大肠杆菌中，大多数是不致病的肠道常在菌，少数具有致病性。大肠杆菌病又称大肠杆菌性腹泻，是由致病性大肠杆菌引起的一种急性传染病。自从1894年大肠杆菌病首次在瑞典、荷兰、法国等养殖业发达国家暴发以来，给世界畜牧业造成了巨大损失[2]。该病的主要特征为败血症和严重腹泻、脱水，引起幼畜大量死亡或发育不良。随着我国畜牧业规模化、集约化饲养模式的发展，该病的发病率和死亡率逐年增加。

    2014年3～4月间，湖北省某规模化肉牛场发生了以高热，食欲废绝，排水样、糊状或褐色粪便，少数排血样粪便，最终消瘦乃至死亡等症状的传染性疾病，全场发病率达30%，犊牛发病率高达76%，死亡率达5%。

    为了弄清本次发病的主要病因，无菌采集病牛腹泻物，从中分离出致病性大肠杆菌，并对分离获得的菌株进行了生物学特性研究。

    1 材料与方法

    1.1 病料

    病牛腹泻物。无菌采集，采样人带一次性无菌手套直肠采集，保证一头牛一个手套，防止交叉污染。

    1.2 培养基的制备

    1.2.1 普通琼脂培养基 量取牛肉汤500 mL，加入5 g蛋白胨、2.5 g氯化钠，放蒸汽锅内加温30 min，调整pH为7.2～7.4，再置蒸汽锅内加热30 min，用滤纸过滤。加入15 g的琼脂，置蒸汽锅内加热至完全溶解。分装于锥形瓶中，置高压蒸汽锅内， 121 ℃灭菌20 min。待冷却至50 ℃左右时倒入灭菌的培养皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。

    1.2.2 血液琼脂培养基 取上述经灭菌后的普通琼脂冷至50 ℃左右的普通琼脂100 mL，无菌加入家兔脱纤维血液15 mL，混匀后倒入灭菌的培养皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。

    1.2.3 伊红美兰琼脂培养基 取上述经灭菌后的普通琼脂100 mL溶解灭菌，并冷却至60 ℃左右，分别加入灭菌的20%乳糖溶液2 mL、2%伊红水溶液2 mL及5%美蓝水溶液1 mL，混匀后倾入灭菌平皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。

    1.2.4 SS琼脂 牛肉膏2.5 g、蛋白胨2.5 g、琼脂9 g加入500 mL蒸馏水中，加热溶解。再加入胆盐4 g、乳糖5 g、枸橼酸钠6 g、硫代硫酸钠6 g及枸橼酸铁0.25 g，微热加温使其全部溶解，调整pH为7.2。混匀后倾入灭菌平皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。

    1.2.5 麦康凯培养基 取蛋白胨2.0 g、氯化钠0.5 g、乳糖1.0 g、胆盐0.5 g和100 mL蒸馏水，调整pH为7.4，加入2.5g琼脂，分装于锥形瓶中，121 ℃灭菌15 min，待冷至50 ℃左右时，加入灭菌的1%中性红水溶液0.5 mL，摇匀后倾入培养皿，完全冷却后4 ℃保存备用。

    1.2.6三糖铁培养基 取适量三糖铁琼脂粉，加入100 mL蒸馏水，加热溶解，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷至50 ℃左右时分装试管，使成底层较深的斜面。

    1.3 试剂

    微量生化鉴定管为杭州微生物试剂有限公司产品，购自武汉市某商业公司。

    1.4 试验动物

    8～10 g SPF昆明鼠，购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心。

    1.5 细菌的分离培养与鉴定

    采用需氧和厌氧（缸内燃烛法）两种方法，利用普通琼脂培养基从病料中分离细菌。对不同形态的菌落进行涂片、染色、镜检和纯培养。将纯培养菌接种于5%血液营养琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、三糖铁培养基、麦康凯培养基，37 ℃培养24 h，观察细菌培养特性。

    1.6 分离菌生化试验

    取生长良好的红色菌落接种于营养肉汤，37 ℃培养 24 h，按常规方法进行生化试验，主要包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖的发酵试验，硫化氢、丙二酸盐利用、枸橼酸盐利用、鸟氨酸盐脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖磷酸盐、卫茅醇试验等。

    1.7 动物试验

    将细菌纯培养物接种于普通肉汤中培养24h，分别以口腔和腹腔途径各接种5只SPF昆明小鼠，每只接种0.2 mL（约含108 CFU/mL）菌液，另取2只作为对照，隔离饲养观察。

    2 结果与分析

    2.1 分离菌的形态

    自患牛腹泻物中分离获得纯化菌株1株。该分离菌为兼性厌氧菌，在普通营养琼脂培养基上就可以生长，显微镜下可以见到菌体短小，两端钝圆、着色较深， 无芽孢，多呈单个排列， 个别形成短链状排列，革兰氏染色阴性（图1）。

    2.2 分离菌培养特性

    分离菌在普通琼脂培养基上生长良好，为中等大小、边缘整齐、光滑湿润、有圆形隆起的菌落。最适生长温度为 37 ℃，最适生长 pH 为 7.2～7.4。分离菌在麦康凯琼脂培养基上形成光滑的红色菌落；在伊红美蓝琼脂培养基上产生黑色，具有金属光泽的小菌落；在 ss 琼脂培养基上一般不生长或生长较差，菌落明显比前两种的小；在三糖铁琼脂斜面培养基上形成黄色斜面，黄色底层并有少量气泡产生；在血液琼脂培养基上 37 ℃培养 24 h 后可以形成灰色菌落，菌落表面光滑、边缘整齐，菌落周围有明显的 α、β溶血环。

    2.3 分离菌生化试验结果

    分离菌株的生理生化特性见表1。分离菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，不发酵蔗糖、卫茅醇，液化明胶，葡萄糖磷酸、硫化氢、枸橼酸盐、丙二酸盐试验阴性；鸟氨酸盐脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脱氨酶试验阳性。

    注：“+”表示为阳性；“-”表示为阴性。

    2.4动物试验结果

    两种途径接种的小鼠在 24～48 h 内均死亡，而对照组的小鼠则全部健活，并且从死亡小鼠的肝组织中分离到接种菌。

    3 小结与讨论

    根据临床症状结合实验室诊断，可以确诊该牛厂发生的牛腹泻是由致病性性大肠杆菌引起的。

    在大肠杆菌的致病过程中，纤毛抗原和肠毒素是两种主要的致病因子[3，4]。肠致病性大肠杆菌首先是利用纤毛抗原粘着于小肠黏膜的上皮细胞上，然后大量繁殖，并产生肠毒素。消化道途径是致病性大肠杆菌侵入机体的主要途径，它通过菌体表面的一种对宿主特异性的粘附因子粘附到宿主小肠黏膜表面并繁殖，分泌肠毒素，引起肠黏膜细胞水与电解质的代谢紊乱，导致腹泻[5]。

    本次疫病的发生主要是受外界不良因素的刺激。由于畜舍内环境卫生条件较差，导致动物机体抵抗力降低，再加上致病菌的大量繁殖，造成动物发病。为降低该病的发生，在今后的饲养管理过程中，应注意环境清洁，保持畜舍清洁干燥，及时清除粪便和污物，最好能够每日用菌毒杀对牛栏消毒1次，同时合理搭配日粮，尽量减少应激反应，增强机体的抗病力。

    对于该病的预防，可以选择与本场致病菌血清型一致的大肠杆菌苗或用本场致病菌株制备自家菌苗进行免疫。发病时，通过药敏试验筛选有效的抗菌药物进行治疗。

    本次分离获得的致病性大肠杆菌是何种血清型及其药物敏感性分析，有待于进一步研究。

    参考文献：

    [1] 王德志.中药抑制牛源致病性大肠杆菌对环丙沙星耐药的研

    究[D].黑龙江大庆：黑龙江八一农垦大学，2009.

    [2] 徐 兵. 潍坊地区肉鸡大肠杆菌病的病原分离鉴定与防控研

    究[D].山东泰安：山东农业大学，2012.

    [3] 高 研，李卫芬， 马国霞. 产肠毒素大肠杆菌主要致病因子及其致病机理的研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯 ，2006（5）2-5.

    [4] 崔玉东，刘桂清，朴范泽.育成牛大肠杆菌肠毒血症病原分离鉴定[J].中国兽医杂志，1994，20（1）：9-10.

    [5] 陈明勇，陈德成，贾君镇，等.牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究[J].中国预防兽医学报，2002，24（4）：277-279.

    2.3 分离菌生化试验结果

    分离菌株的生理生化特性见表1。分离菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，不发酵蔗糖、卫茅醇，液化明胶，葡萄糖磷酸、硫化氢、枸橼酸盐、丙二酸盐试验阴性；鸟氨酸盐脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脱氨酶试验阳性。

    注：“+”表示为阳性；“-”表示为阴性。

    2.4动物试验结果

    两种途径接种的小鼠在 24～48 h 内均死亡，而对照组的小鼠则全部健活，并且从死亡小鼠的肝组织中分离到接种菌。

    3 小结与讨论

    根据临床症状结合实验室诊断，可以确诊该牛厂发生的牛腹泻是由致病性性大肠杆菌引起的。

    在大肠杆菌的致病过程中，纤毛抗原和肠毒素是两种主要的致病因子[3，4]。肠致病性大肠杆菌首先是利用纤毛抗原粘着于小肠黏膜的上皮细胞上，然后大量繁殖，并产生肠毒素。消化道途径是致病性大肠杆菌侵入机体的主要途径，它通过菌体表面的一种对宿主特异性的粘附因子粘附到宿主小肠黏膜表面并繁殖，分泌肠毒素，引起肠黏膜细胞水与电解质的代谢紊乱，导致腹泻[5]。

    本次疫病的发生主要是受外界不良因素的刺激。由于畜舍内环境卫生条件较差，导致动物机体抵抗力降低，再加上致病菌的大量繁殖，造成动物发病。为降低该病的发生，在今后的饲养管理过程中，应注意环境清洁，保持畜舍清洁干燥，及时清除粪便和污物，最好能够每日用菌毒杀对牛栏消毒1次，同时合理搭配日粮，尽量减少应激反应，增强机体的抗病力。

    对于该病的预防，可以选择与本场致病菌血清型一致的大肠杆菌苗或用本场致病菌株制备自家菌苗进行免疫。发病时，通过药敏试验筛选有效的抗菌药物进行治疗。

    本次分离获得的致病性大肠杆菌是何种血清型及其药物敏感性分析，有待于进一步研究。

    参考文献：

    [1] 王德志.中药抑制牛源致病性大肠杆菌对环丙沙星耐药的研

    究[D].黑龙江大庆：黑龙江八一农垦大学，2009.

    [2] 徐 兵. 潍坊地区肉鸡大肠杆菌病的病原分离鉴定与防控研

    究[D].山东泰安：山东农业大学，2012.

    [3] 高 研，李卫芬， 马国霞. 产肠毒素大肠杆菌主要致病因子及其致病机理的研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯 ，2006（5）2-5.

    [4] 崔玉东，刘桂清，朴范泽.育成牛大肠杆菌肠毒血症病原分离鉴定[J].中国兽医杂志，1994，20（1）：9-10.

    [5] 陈明勇，陈德成，贾君镇，等.牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究[J].中国预防兽医学报，2002，24（4）：277-279.

    2.3 分离菌生化试验结果

    分离菌株的生理生化特性见表1。分离菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，不发酵蔗糖、卫茅醇，液化明胶，葡萄糖磷酸、硫化氢、枸橼酸盐、丙二酸盐试验阴性；鸟氨酸盐脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脱氨酶试验阳性。

    注：“+”表示为阳性；“-”表示为阴性。

    2.4动物试验结果

    两种途径接种的小鼠在 24～48 h 内均死亡，而对照组的小鼠则全部健活，并且从死亡小鼠的肝组织中分离到接种菌。

    3 小结与讨论

    根据临床症状结合实验室诊断，可以确诊该牛厂发生的牛腹泻是由致病性性大肠杆菌引起的。

    在大肠杆菌的致病过程中，纤毛抗原和肠毒素是两种主要的致病因子[3，4]。肠致病性大肠杆菌首先是利用纤毛抗原粘着于小肠黏膜的上皮细胞上，然后大量繁殖，并产生肠毒素。消化道途径是致病性大肠杆菌侵入机体的主要途径，它通过菌体表面的一种对宿主特异性的粘附因子粘附到宿主小肠黏膜表面并繁殖，分泌肠毒素，引起肠黏膜细胞水与电解质的代谢紊乱，导致腹泻[5]。

    本次疫病的发生主要是受外界不良因素的刺激。由于畜舍内环境卫生条件较差，导致动物机体抵抗力降低，再加上致病菌的大量繁殖，造成动物发病。为降低该病的发生，在今后的饲养管理过程中，应注意环境清洁，保持畜舍清洁干燥，及时清除粪便和污物，最好能够每日用菌毒杀对牛栏消毒1次，同时合理搭配日粮，尽量减少应激反应，增强机体的抗病力。

    对于该病的预防，可以选择与本场致病菌血清型一致的大肠杆菌苗或用本场致病菌株制备自家菌苗进行免疫。发病时，通过药敏试验筛选有效的抗菌药物进行治疗。

    本次分离获得的致病性大肠杆菌是何种血清型及其药物敏感性分析，有待于进一步研究。

    参考文献：

    [1] 王德志.中药抑制牛源致病性大肠杆菌对环丙沙星耐药的研

    究[D].黑龙江大庆：黑龙江八一农垦大学，2009.

    [2] 徐 兵. 潍坊地区肉鸡大肠杆菌病的病原分离鉴定与防控研

    究[D].山东泰安：山东农业大学，2012.

    [3] 高 研，李卫芬， 马国霞. 产肠毒素大肠杆菌主要致病因子及其致病机理的研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯 ，2006（5）2-5.

    [4] 崔玉东，刘桂清，朴范泽.育成牛大肠杆菌肠毒血症病原分离鉴定[J].中国兽医杂志，1994，20（1）：9-10.

    [5] 陈明勇，陈德成，贾君镇，等.牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究[J].中国预防兽医学报，2002，24（4）：277-279.