猪流行性腹泻预防及诊断研究进展
张冰 关增春 于晓娜 刘学
摘要：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，近几年PED的流行特点和发病情况发生很大的变化，给防治工作带来了许多困难，对养猪业造成巨大的经济损失。本文从猪流行性腹泻的疫苗免疫和实验室诊断两个方面进行综述，为猪流行性腹泻的防控提供参考。
关键词：猪流行性腹泻；疫苗免疫；实验室诊断
中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）09-0084-03
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征。各种年龄的猪均易感[1]，但对哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的危害更大，尤其是哺乳仔猪危害最为严重。该病自1971年在英国首先报道了PEDV的发生，相继在比利时、德国、瑞士、日本等许多国家报道了本病的发生[2]。1973年，类猪传染性胃肠炎的急性腹泻首先在我国上海发生，但是直到1984年，才经荧光抗体试验和血清中和试验证实该病的病原是PEDV[3]。到目前为止，我国已有24个省报道了PED的发生和流行情况[4]。PED主要发生在冬春季节，病毒主要通过感染猪的粪便而传播，自然感染病例大多是经口摄入而感染，粪—口途径是该病的主要传播途径[5]。PEDV感染2周龄仔猪引起呕吐、腹泻、脱水为特征的急性肠道传染病，死亡率高达100%，对世界范围内的养猪业均造成极大的威胁。随着如今集约化、规模化养殖的发展，给该病的传播创造了有利条件。疫苗免疫是猪流行性腹泻免疫预防的主要手段，而由于该病的流行病学和临床症状方面与猪传染性胃肠炎无显著差别，因此必须借助于实验室检查方法才能确诊。本文从该病疫苗预防和实验室诊断两方面介绍猪流行性腹泻的预防和诊断的研究情况。
1 PED疫苗的研究
1.1 PED组织灭活苗
PEDV的沪毒株（S株）接种3～9日龄仔猪，待典型发病后采集病猪小肠组织及内容物，制备PED氢氧化铝灭活苗，该疫苗经后海穴注射，对仔猪的主动保护率为85%，被动保护率为97.06%。接种后2周开始产生免疫力，免疫期可达6个月[6]。
1.2 PED细胞灭活苗
由于组织灭活苗存在操作繁琐、生产成本高及质量难以控制等缺点，因此采用在病毒培养液中加适量胰酶的培养方法，将PEDV CV777适应于Vero细胞，以2代毒制备氢氧化铝灭活苗，后海穴接种对仔猪的主动免疫保护率为85.19%被动免疫保护率为85%[7]。通过该方法制备的PED细胞灭活苗可用于现在PEDV的预防与控制。
灭活疫苗具有安全、稳定的优点，但同时具有需要大剂量接种或者应用浓缩抗原；免疫期短常需强化接种；不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；产生完全免疫力需要2周；不利于紧急预防接种与降低疫苗费用等缺点。
1.3 PED弱毒苗
目前，PED的商品化弱毒疫苗主要有我国的CV777株，日本的P-5V株和韩国的KPED-9株、DR13株。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研究将适应Vero细胞的CV777株从90代起进行克隆纯化，克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主动免疫与被动免疫的保护率分别达到95.92%及96.2%。稳定性试验经6代次的返祖传代仍是稳定的，未见毒力返强[8]。日本的P-5V株虽然没有连续传代致弱的相关报道，却在日本和韩国用于PED的预防。韩国的KPED-9是由从新生仔猪分离的KPEDV-9通过Vero细胞连续传代93代后制备而成的；DR13是由从患病仔猪小肠内容物分离的DR13强毒通过Vero细胞连续传代而成，该疫苗是韩国用于预防PED的口服疫苗。
1.4 转基因植物疫苗
转基因植物作为口服疫苗有可能产生理想的黏膜免疫反应，从而达到预防病毒性腹泻病的目的。Yang等[9]将PEDV的S基因转入烟草中，提取转基因植物蛋白给小鼠注射，证明其具有免疫原性。给小鼠饲喂这种转基因植物可诱导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫。Yang等[10]相继应用脓杆菌介导的蛋白转入法将PEDV的S基因的主要抗原位点（命名为K-COE）和合成的PEDV中和抗原表位在烟草中表达。这些研究为研制PEDV口服转基因植物疫苗提供了新的思路。目前，在以烟草花叶病毒为载体的无烟碱烟草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表达，用表达蛋白免疫接种后，对仔猪具有良好的保护作用，为PEDV转基因植物疫苗的研究奠定了基础。植物的多种优越性均可被用于研究转基因疫苗，并且已经取得了很大的进展。但仍有一些障碍必须克服，如蛋白在植物中的表达水平低、表达产物在植物中的稳定性差、转基因口服疫苗在产生免疫反应之前在胃肠道内有时被消化等[11]，科学家就这些问题进行了研究并正在加以解决。
1.5 多价联合疫苗
1.5.1 TGEV与PEDV二联疫苗 目前，在我国用于PED预防和控制的疫苗主要是PED-TGE二联苗。由于PEDV和TGEV均属于冠状病毒，而且致病机理相似，组织嗜性相同。因此，研制联苗亦是可行的。二联疫苗的特点是：毒价高，后海穴接种，增强了免疫保护力，一次接种即可，省时、省力，且保护率高。
1.5.2 EDV、TGEV、RV三联灭活苗 上海农科院畜牧兽医研究所钱永清等[12]采用猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（RV）细胞培养物制备了三联灭活疫苗。实验室免疫结果表明，妊娠母猪和育肥猪免疫后15 d达到较高的免疫水平，免疫有效期超过6个月，妊娠母猪所产仔猪可获得高水平的被动免疫保护。试验场应用结果表明，母猪保护率达98%，仔猪被动免疫保护率达93%。
1.6 展望
随着分子生物学的发展，20世纪90年代初基因疫苗得到了发展。与传统的弱毒或灭活疫苗相比，DNA疫苗具有不散毒、不返强的优点。此外乳酸杆菌作为微生态制剂中的主要益生菌，广泛应用于食品、饲料加工业。构建乳酸杆菌质粒载体，表达在黏膜系统中增殖的病原微生物的保护性抗原基因，制备绿色环保、可食用的多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗应用前景广阔。而黏膜免疫恰恰是防治TGE和PED的主要途径。因此未来基因疫苗和微生态制剂对猪流行性腹泻的预防上有着很好的发展前景。
2 PED的实验室诊断
2.1 病毒的分离鉴定
有研究表明，用含有60 μg/mL胰酶液的细胞培养液中进行PEDV传代适应，在第3代就出现明显的CPE，第5代毒价可达10～7.0/0.1 mL，并通过乳猪回归试验和特异性中和试验证实所增殖的病毒为猪流行性腹泻病毒[13]。这些病毒分离鉴定的方法对PED血清学、病原学、免疫学等方面的研究提供了一个良好的技术平台，但由于病毒的分离鉴定需要有一套成熟的细胞培养体系，而且PEDV需要在细胞系中连续传代才能出现明显的CPE，目前尚无法推广应用。
2.2 微量血清中和试验
林志雄等[14]利用已适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒PEDV-G1株，以PK-15作指示细胞，与被检血清进行微量中和，测定待检血清中的特异性抗体，48 h进行结果判定，证实该方法可以用来检测猪流行性腹泻病毒，而且检测结果准确、可靠，具有较高的敏感性，可用于大规模的流行病学调查，并建立了PED微量血清中和试验。但该方法需要标准毒株作为指示毒株和成熟的细胞培养体系，实验条件的限制因素比较多，很难在短期内应用于临床实践。
2.3 免疫电镜法（IEM）
该方法简便、直观、快速、定性准确，但该方法要求有价格高昂的电镜设备，而且电镜检查一般需3～7 d才能出报告，不适用于大规模临床诊断[15]。
2.4 免疫荧光法
试验研究证明，用直接免疫荧光法（FAT）检查病料中的猪流行性腹泻抗原是可靠的特异性诊断方法，目前应用最为广泛。崔现兰等对免疫荧光法用于猪流行性腹泻的诊断进行了大量的探索，结果表明：FAT的检出率为91.4%，间接免疫荧光法（IFAT）的检出率为89%，而且比电镜更敏感、更可靠。由于该方法需要在病死猪只或在腹泻早期扑杀后取肠道组织制备切片，故很难用于临床诊断。
2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA试验可直接应用于粪便中PEDV的检测，而且比电镜更敏感可靠，应用较为广泛。韩国学者Kim O等建立了可在福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织中准确而特异的检出PEDV的单克隆抗体基础上的免疫组化法，该方法也可用于鉴别诊断PEDV与TGEV。但该方法对病料的前期处理比较繁琐。
2.6 反转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）
近年来，随着分子生物学的发展，对于PEDV和TGEV核酸的检测方法越来越受到人们的重视。有研究表明，RT-PCR法是目前鉴别诊断TGEV和PEDV最敏感、特异的方法。传统方法诊断主要从病毒的分离与鉴定、抗原检测、电镜检测、血清学诊断等方面进行。与传统方法比较，RT-PCR方法只需要病猪的粪便即可进行活体诊断，便于疾病的早期诊断，敏感性和特异性高，而且操作步骤更加快速、方便，一般4～6 h内可以提供准确的结果。
2.7 展望
传统的PEDV诊断方法最常用的是病毒分离，但耗费时间长，往往使防治错过了最佳时机。近年来发展的PCR技术有效地解决了这些不足，但是普通RT-PCR在定量研究上仍不能尽如人意。SYBR GreenⅠ荧光染料定量PCR技术是在反应管中加入荧光染料，这种染料可嵌入双链DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激发产生荧光。随着扩增反应的延伸，荧光信号会因为DNA产物的增加而增加，因此SYBR GreenⅠ荧光信号的积累与扩增出的双链DNA的数量成正相关。该方法具有操作简便，敏感性高，重复性好，污染少，用时短和可自动定量分析等优点，已成为病原检测的重要方法。该方法也为建立区分PEDV强弱毒的荧光定量PCR方法、鉴别诊断PEDV与TGEV的荧光定量PCR方法及多重复合荧光定量PCR方法奠定了重要基础。
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