细胞标本取材和制片方法
李旭
摘要：细胞标本取材和制片方法在病理诊断过程中占有重要位置。简要介绍了印片法、穿刺法、沉淀法等活细胞标本的制备方法。
关键词：细胞标本；取材；制片
中图分类号：S854.4+3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）09-0079-03
随着疾病的发生、发展，病理标本在疾病的诊断过程中越来越重要。病理标本的检查应包括大体和显微镜下观察两个方面，而正确的诊断往往取决于准确的显微镜下观察，因此制片质量的好坏将直接影响诊断结果的准确性，甚至会带来错误的结果。一张好的切片与取材和固定都有密切的关系。对于免疫组织化学方法所需材料的取材，不仅要求组织细胞的形态完整保存，而且要最大程度的保存组织或细胞成分的抗原性。
1 印片法
印片法的优点是简便、快速、经济、准确，特别是前三方面超过任何一种冰冻切片及快速石蜡切片法。它不需要特殊设备，凡病理室均可开展。特别适用于县以下没有冰冻切片设备和条件的病理室。印片法的速度特快，仅数分钟即可出结果。在准确性方面与一般冰冻切片相同。印片中的细胞形态比之在较厚的冰冻切片中所观察到的细胞形态结构更为清晰可辨，细胞畸形远较冰冻切片显著。
冯毓正等[1]曾遇到两例乳腺硬癌，冰冻切片观察难以与硬化性乳腺病鉴别，而是结合印片中发现恶性细胞才确诊为硬癌。根据乳腺标本的肉眼观察结合印片中有无恶性细胞对某些乳腺病变也能做出初步的诊断。一般说来，印片法是一种病理诊断的辅助方法。无论石蜡切片或冰冻切片辅之以印片，互补短缺，对于进一步提高病理诊断的准确性均有极大的帮助。冯毓正等[1]认为印片法不仅只是冰冻及石蜡切片的辅助诊断方法，它可以代替冰冻切片对乳腺肿块进行快速诊断。
邝国乾等[2]采用印片法检测AgNOR可结合印片细胞学检查，使诊断鼻咽癌的敏感性、特异性、实用性等都有提高。因此，印片法优于切片法。本方法作为诊断鼻咽癌，具有操作简单、经济、实用、准确、可靠、重复性好，易于普及推广。
崔海等[3]在研究认为使用印片法可提高外科医师术中对胃癌浆膜浸润或浸出情况的判断准确率，减少肉眼判断上的误判或漏判，而且方法简便、快速。需要指出的是，在做印片取材时，应小心轻柔操作，更不能用刮片的方法，以免人为引起癌细胞的扩散转移。
2 穿刺法
目前临床上常用的穿刺方式有两种：绳梯式和纽扣式穿刺方式。纽扣式穿刺方式穿刺点固定，穿刺区域小，易使血管周围形成疤痕和动脉瘤，未穿刺的血管和组织形成塌陷，影响血流量。但是由于纽扣式穿刺方式疼痛度低，患者对于它的依从性较高。而绳梯式穿刺方式，虽然有纽扣式穿刺方式无法超越的优越性一血管受力均匀、对血管壁的损伤小、不易引起动脉瘤的发生，但因其每次穿刺需要更换新的穿刺点、疼痛度高而往往不被患者所接受。目前，广泛应用的穿刺法大多数是改良过的。
2.1 改良穿刺法的临床应用
自体动静脉内瘘是终末期肾病患者进行维持性血液透析最常用的血管通路，是患者赖以生存的“生命线”。如何选用最佳的穿刺方法，减轻透析患者反复穿刺带来的疼痛，减少并发症的发生，保护好动静脉内瘘管，延长其使用寿命，是广大医护人员值得研究和探讨的问题。李春艳等[4]研究了针尖斜面向下的穿刺方法，对于减轻穿刺疼痛也有一定的效果。动静脉内瘘穿刺广泛应用的常规法是针尖斜面朝上进行穿刺，沈娴，等[5]采用改良法，即针尖斜面向右旋转45°，同时增大进针角度，减轻了患者穿刺时的疼痛，减少了穿点渗血次数及压迫止血时间，效果满意。对于患者而言，使用改良穿刺法后疼痛度减轻的效果越明显。疼痛度一旦减轻，患者对于穿刺方式的选择依从性大大提高，从而达到避免并发症的发生、有效保护动静脉内瘘管的目的。
经外周中心静脉置管（PICC） 是用于为患者提供中期到长期的静脉输液治疗而留置的中心静脉导管，经外周静脉穿刺插管，使其末端位于上腔静脉的下1/3处或上腔静脉与右心房交界处的深静脉导管置入术[6]。PICC在临床应用中仍不可避免地发生各种并发症，其中导管头端的异位不仅影响PICC的正常使用，甚至可以引起各种并发症，严重时需拔除后二次置管，从而增加了患者的痛苦和经济负担。临床上PICC的异位多发生于颈内静脉、锁骨下静脉、腋静脉等部位，而导管异位至颈内静脉最为常见，发生率3%～37%[7]。颈内静脉是颈部最粗大的静脉，且其管腔经常处于开放的状态[8]，也为导管误入提供了解剖上的基础。传统的穿刺法是让患者抬头，将头靠近穿刺侧的肩部。其目的是为了使锁骨下静脉与颈内、外静脉之间形成一锐角，从而阻止导管进入颈静脉[9]。传统穿刺法患者在穿刺过程中因为担心错过配合的时间而一直处于紧张焦虑状态；配合时患者需要抬头，抬头使颈部肌肉紧张，舒适度降低加重了焦虑的情绪；在配合过程中患者始终担心自己配合的动作是否正确从而产生过重的心理负担，导致血管痉挛造成送管困难，降低了穿刺的成功率； 由于患者采取的体位不正确，也增加了导管异位的发生率； 另外，传统穿刺法由于需要患者的配合，对于老年、危重、体弱以及配合度差的患者也容易发生颈内导管异位。运用传统穿刺法的异位发生率为17%，许剑蕾[10]为了减轻患者的痛苦，保证导管的顺利置入，改良穿刺法全程由护士担当配合者，护士接受过专业医学知识的培训并了解整个穿刺的过程。护士按压锁骨上窝近胸锁关节处，使颈内静脉受压变瘪，从而避免导管误入颈内静脉； 改良穿刺法患者不需要做任何配合动作，同时配合护士在穿刺过程中不断地与患者交流使其处于放松状态，降低了患者的焦虑程度，增加了舒适度，使全身肌肉和血管放松，便于导管的送入，增加了穿刺的成功率。改良穿刺法配合护士在按压时可以感觉到导管误入到颈内静脉，及时让操作者进行调整从而降低颈内导管异位的发生率。
2.2 扣眼穿刺法研究进展
1977年波兰学者Twardowski首次对1例血管长度受限的患者采取固定穿刺点穿刺，并称之为固定点穿刺法。1984年Kronung将此法用于居家透析患者并更名为扣眼穿刺法。20世纪80年代起扣眼穿刺法在欧洲非常流行，并被美国肾脏病临床实践指南推荐为自体内瘘的首选穿刺方法[11]。扣眼穿刺法的特点：第1步是隧道的形成，穿刺时要求每次都通过同一个皮肤穿刺点和血管穿刺点进针。第2步，隧道形成后要改用钝针穿刺，钝针是指针尖及边缘不锋利、没有切割作用的内瘘穿刺针。如果没有形成隧道，钝针就无法到达血管腔，而隧道形成后还用锐针，则容易出现穿刺点出血[12]。扣眼法与传统方法相比明显降低了血管瘤和血肿的发生率[13，14]，适用于新旧内瘘，容易穿刺，减少护士的操作时间，且患者可以自己穿刺[15，16]。
3 沉淀法
一般情况下，脑脊液、浆膜腔液中细胞数量很少，需进行细胞收集后才能作细胞学检查。教科书和一些操作手册中，往往只介绍离心沉淀法收集细胞，其优点是操作简便、收获细胞多，但该法有明显的缺陷，由于标本中蛋白质含量过低等因素影响，加上离心力的作用，细胞形态结构易被破坏，尤其是一些具有诊断意义的细胞如肿瘤细胞等，更易被破坏，从而影响细胞学检查结果。
利用细胞自然沉降作用，同时使用滤纸将水分吸出，加速细胞的沉降，收集细胞于玻片上后进行细胞学检查。此方法不影响细胞的形态结构，可作各种染色以进行细胞学检查。不仅粒细胞、淋巴细胞形态结构完整，其他细胞如间皮细胞、各种肿瘤细胞、淋巴样细胞、单核样细胞、室管膜细胞等也都结构清晰，基本上与血片、骨髓片中的细胞清晰度一致。标本不宜久置，收取标本后应马上进行收集细胞的操作，否则细胞易变形。自然干燥时间太长也会导致细胞形态结构的改变，可用电吹风吹干。该法缺点是操作稍费时，消耗的标本不能作其他项目检查。但克服了离心沉淀法的明显不足，能保持细胞形态、结构的本来面目，有利于明确细胞学诊断。
将细胞沉淀法应用于良恶性腹水鉴别，效果良好。与常规离心沉淀法相比，获取的细胞量明显增多，细胞形态清晰完整，可与血片及骨盈片相比拟。能辨认恶性细胞的特征，而且所需的标本量极少，在积液很大及腹水中细胞含量少的情况下，更具有其优越性。
既往诊断小儿恶性血液病主要靠中枢神经系统症状、体征、CSF三项检查（压力、白细胞计数、蛋白定量）及试管离心沉淀涂片找肿瘤细胞。用玻片离心沉淀法进行CSF细胞学检查，最初用于中枢神经系统白血病的检查。后扩大到所有恶性血液病，体会到这是一种简便、快速、较敏感的方法，在无临床症状、常规三项及试管离心沉淀细胞学都正常时就可找到肿瘤细胞。
4 活细胞标本的制备
活细胞标本的制备多用于科研，用于常规病理诊断的较少。标本主要来源于建株的培养细胞、短期培养细胞和外周血等。细胞可直接培养在盖玻片上，固定后即可进行染色观察或进行免疫组织化学染色或扫描电镜标本制备。也可培养于培养瓶或培养板内，制成细胞悬液，收集一定的细胞还可进行涂片。可以经离心后进行透射电镜标本制备。
5 小结
大量报道表明，病理切片已成为诊断疾病的重要手段。并且细胞标本的取材和制备方法在病理切片诊断中起着至关重要的作用。目前，上述四种方法虽然在不同领域中成功应用，但仍然有一些局限性。因此，对细胞标本取材和制片方法的的研究还有待更进一步深化。
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