超高效液相色谱—串联质谱多目标分析沉积物中的微量有机紫外线吸收剂
欧玮辉 唐才明 王春维 金佳滨 彭先芝
摘 要 利用超声波辅助萃取、通过硅胶柱层析法净化，联合超高效液相色谱-串联质谱技术建立了同时检测沉积物中12种微量有机紫外线吸收剂的定性定量方法。优化了萃取条件，比较了净化过程中硅胶活化温度、洗脱剂种类和体积对回收率的影响。样品在甲醇中经超声波辅助萃取3次，每次15 min； 硅胶活化温度为160 ℃，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷混合液（1∶1， V/V）； 质谱采用大气压力化学电离源正离子模式，数据采集为选择反应监测模式。目标物的回收率为55%～118%，方法定量限为1～250 pg/g，有效控制了基质干扰。采用本方法初步分析了珠江广州城市河段表层沉积物中的有机紫外线吸收剂，除UV-327外，其它目标物均被检出，含量最高可达12.0 ng/g（干重）。
关键词 超声波辅助萃取； 超高效液相色谱-串联质谱； 紫外线吸收剂； 硅胶柱净化
1 引 言
紫外线吸收剂被广泛应用于化妆品、洗发水等个人护理品，以减弱太阳紫外线对皮肤和毛发的伤害【1～3】； 此外，紫外线吸收剂也被添加到纺织品、塑料、汽车抛光剂等工业品以延缓产品老化【4～6】。紫外线吸收剂可通过皮肤和衣物洗涤（如沐浴、衣服清洗等）、娱乐性活动（如游泳）、垃圾渗滤液渗透等多种途径直接进入环境，亦可经处理/未处理的污水和污泥排放间接进入环境【4，7】。研究表明，紫外线吸收剂在地表水、污水和污泥中广泛存在【6～9】，有些紫外线吸收剂甚至可在生物体中富集【5，7，10，11】。同时，有机紫外线吸收剂被证实具有有内分泌干扰效应【12，13】。
目前，紫外线吸收剂的分析多采用气相色谱-质谱联用法【2，10，14】和液相色谱-质谱联用法【4，5，15】，检出限一般在ng/g或ng/L量级。如刘伟等【16】 采用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）建立了同时测定运动饮料中 9 种紫外线稳定剂的分析方法，Poiger等【17】用GC-MS建立了瑞士湖泊水体中4种常用紫外线吸收剂的分析方法； Liu等【18】报道了污水处理厂进出口污水中6种紫外线吸收剂的GC-MS/MS分析方法； Zhang等【4】运用液相色谱-质谱联用法建立了沉积物和污水处理厂污泥中5种二苯甲酮类紫外线吸收剂的分析方法； 高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）亦被用于鱼体内有机紫外线吸收剂的检测【5】。
环境介质中有机紫外线吸收剂的通常须经过萃取浓缩以后才能进行仪器分析。常用的固体介质中有机紫外线吸收剂的萃取方法有索氏抽提【11】、加压流体萃取（PLE）【6，10，18】、超声波辅助萃取（USE）【19】和微波辅助萃取（MAE）【9】等。此外，由于环境样品的复杂性，萃取后的样品一般需经净化，降低基质干扰，以提高分析灵敏度和准确性【10】。
已有的研究样品前处理耗时较长、溶剂用量多、操作繁琐，且通常只能分析某一类别几种有机紫外线吸收剂【9】。此外，分析方法大多集中在水体中有机紫外线吸收剂的检测【7，8，15】，而对更为复杂的固体基质，如沉积物中有机紫外线吸收剂的分析方法的报道较少【1】。本研究以我国使用最广泛的有机紫外线吸收剂为目标物，样品经硅胶层析柱分离净化，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测，建立了针对沉积物中5类12种有机紫外线吸收剂的多目标分析方法。目标物定量限多在1～4 pg/g（干重），可用于深入研究有机紫外线吸收剂在环境中的分布及其环境行为。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
TSQ Vantage三重四极杆质谱仪，配有Accela 1250四元泵和Accela自动进样器的液相色谱系统（美国Thermo Fisher公司）； YJ-5200D超声机（中国宁波市鄞州甬杰实验仪器有限公司）； Syncore Polyvap R-12平行蒸发仪（瑞士Buchi公司）； TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）。
分析物和内标：二苯甲酮-3（BP-3，98%）、2-羟基-4-正辛氧基二苯甲酮（UV-531，98%）、对甲氧基肉桂酸辛酯 （EHMC，98%）、4-甲基苄亚基樟脑（4-MBC，98%）、奥克立林（OCR，97%）、对二甲氨基苯甲酸异辛酯（ODPABA，98%）、2-（2′-羟基-3′-叔丁基-5′-甲基苯基）-5-氯苯并三唑（UV-326，98%）、2-2′-羟基-5′-叔辛基苯基）苯并三唑（UV-329，98%）、2-（2′-羟基-3′，5′-二叔丁基苯基）-5-氯代苯并三唑（UV-327，98%）、2-（2′-羟基-3′，5′-二叔戊基苯基）苯并三唑（UV-328，98%）、2-（2′-羟基-5′-甲基苯基）苯并三唑（UV-P，97%）、2-（2H-苯并三唑-2-基）-4，6-二（1-甲基-1-苯基乙基）苯酚（UV-234，98%）和氘代二苯甲酮（BP-d10，98%）购自Sigma-Aldrich公司； 4-MBC-d4（98%C/D/N， 加拿大Isotopes公司。上述化学品的主要物理化学参数以及分子结构见表1。
甲醇和正己烷（德国Merck公司）二氯甲烷（瑞典Oceanpak公司）甲酸和乙酸铵（美国Sigma-Aldrich公司）为色谱纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏集团）。
2.2 标准溶液制备
标准物质及内标化合物在甲醇中配置成10 mg/L储备混合标准液和10 mg/L混合内标溶液。工作混合标准液通过稀释储备混合标准液制得。
2.3 样品采集和处理
在珠江广州河段采集了6个表层沉积物样品（编号为S1，S2，S3，S4，S5和S6），样品用干净的锡箔纸包裹，冷冻干燥后避光保存于
20 ℃备用。
冷冻干燥后的表层沉积物样品经研磨粉碎，过80目筛后得到颗粒均匀的沉积物样品。称取10 g样品于50 mL Nalgene FEP离心管（美国）中，加入混合内标标准溶液至20 ng/g（干重， 下同），混匀。加入20 mL甲醇至离心管中，涡漩混匀后超声波辅助萃取15 min，4000 r/min离心5 min取上清液。萃取过程重复3次，合并所有上清液。上清液减压蒸发至约5 mL，用氮气缓慢吹干， 复溶于1 mL正己烷中。
硅胶（100～200目）在160 ℃下烘烤12 h。取1.5 g已活化的硅胶填于玻璃层析柱（内径0.7 cm）中。用10 mL正己烷润洗硅胶柱后将样品转移至层析柱顶部。用10 mL正己烷淋洗硅胶柱并将该洗脱弃之，然后用15 mL二氯甲烷/甲醇混合溶剂（1∶1， V/V）洗脱目标物。洗脱液在温和的氮气下吹干并定容于1 mL甲醇中，待测。
2.4 色谱质谱条件
2.4.1 色谱条件 ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm），柱前接Phenomenex C18保护柱（4.0 mm×2.0 mm，美国Water公司）。流动相A： 5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸）； 流动相B： 甲醇； 进样量： 5 μL； 流速： 200 μL/min； 柱温： 40 ℃； 梯度洗脱： 0 ～10 min， 50%～20% A； 10～12 min， 20%～10% A； 12～25 min， 10% A； 25～26 min， 10%～50% A； 26～40 min， 50% A。
2.4.2 质谱条件 大气压力化学电离源（APCI）正离子模式； Corona放电电压4.0 μA； APCI汽化器温度350 ℃； 鞘气压力276 kPa； 辅助气压力1.0 MPa； 毛细管温度350 ℃。
3 结果与讨论
3.1 UPLC-MS/MS条件
在流动相中加入适量的醋酸铵可以增强分析物的保留，改善峰形，甲酸则可以提供质子，稳定准分子离子峰，提高分析物的质谱响应【20】。因而，本研究选择5 mmol/L醋酸铵与0.2%甲酸混合溶液和甲醇作为流动相。比较了进样量为5， 10 和20 μL时的色谱分离的效果。进样量为10和20 μL时会造成部分化合物拖尾。所以，进样量定为5 μL。对流动相洗脱梯度进行了优化，使分析物基本上达到了基线分离，如图1所示。
3.5 样品分析
应用该方法初步分析了珠江广州城市河段表层沉积物中有机紫外吸收剂的含量。UV-P， OCR， ODPABA， UV-531， UV-329， UV-326， UV-234和UV-328在所有样品中都存在，含量为0.011～12.0 ng/g。而4-MBC， BP-3和UV 327则仅在个别样品中存在（表5）。珠江河流沉积物中有机紫外吸收剂的分布及其环境行为尚有待进一步研究。
References
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6 Ruan T， Liu R， Fu Q. Environ. Sci. Technol.， 2012， 46（4）： 2071-2079
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11 Nakata H， Murata S，Filatreau J. Environ. Sci. Technol.， 2009， 43（18）： 6920-6926
12 Schlumpf M， Cotton B， Conscience M. Environ. Health. Persp.， 2001， 109（3）： 239-244
13 Coronado M， DeHaro H， Deng X. Aquat. Toxicol.， 2008， 90（3）： 182-187
14 Reddy C M， Quinn J G， King J W. Environ. Sci. Technol.， 2000， 34（6）： 973-979
15 MontesdeocaEsponda S， SosaFerrera Z， Santana-Rodríguez J. J. Sep. Sci.， 2013， 36（13）： 2618-2175
16 LIU Wei， ZHANG Nan， FAN Sai. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（5）： 706-710
刘 伟， 张 楠， 范 赛. 分析化学， 2014， 42（5）： 706-710
17 Poiger T， Buser H R， Balmer M E. Chemosphere， 2004， 55（7）： 951-963
18 Liu Y S， Ying G，Shareef A. Environ. Pollut.， 2012， 165： 225-232
19 Kameda Y， Kimura K， Miyazaki M. Environ. Pollut.， 2011， 159（6）： 1570-1576
20 Gómez M J， Petrovic' M， Fernández-Alba A R. J .Chromatogr. A， 2006， 1114（2）： 224-233
21 XIE Wen， DING Hui-Ying， ZHANG Xiao-Dong. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（12）： 1767-1770
谢 文， 丁慧瑛， 章晓氡. 分析化学， 2005， 33（12）： 1767-1770
摘 要 利用超声波辅助萃取、通过硅胶柱层析法净化，联合超高效液相色谱-串联质谱技术建立了同时检测沉积物中12种微量有机紫外线吸收剂的定性定量方法。优化了萃取条件，比较了净化过程中硅胶活化温度、洗脱剂种类和体积对回收率的影响。样品在甲醇中经超声波辅助萃取3次，每次15 min； 硅胶活化温度为160 ℃，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷混合液（1∶1， V/V）； 质谱采用大气压力化学电离源正离子模式，数据采集为选择反应监测模式。目标物的回收率为55%～118%，方法定量限为1～250 pg/g，有效控制了基质干扰。采用本方法初步分析了珠江广州城市河段表层沉积物中的有机紫外线吸收剂，除UV-327外，其它目标物均被检出，含量最高可达12.0 ng/g（干重）。
关键词 超声波辅助萃取； 超高效液相色谱-串联质谱； 紫外线吸收剂； 硅胶柱净化
1 引 言
紫外线吸收剂被广泛应用于化妆品、洗发水等个人护理品，以减弱太阳紫外线对皮肤和毛发的伤害【1～3】； 此外，紫外线吸收剂也被添加到纺织品、塑料、汽车抛光剂等工业品以延缓产品老化【4～6】。紫外线吸收剂可通过皮肤和衣物洗涤（如沐浴、衣服清洗等）、娱乐性活动（如游泳）、垃圾渗滤液渗透等多种途径直接进入环境，亦可经处理/未处理的污水和污泥排放间接进入环境【4，7】。研究表明，紫外线吸收剂在地表水、污水和污泥中广泛存在【6～9】，有些紫外线吸收剂甚至可在生物体中富集【5，7，10，11】。同时，有机紫外线吸收剂被证实具有有内分泌干扰效应【12，13】。
目前，紫外线吸收剂的分析多采用气相色谱-质谱联用法【2，10，14】和液相色谱-质谱联用法【4，5，15】，检出限一般在ng/g或ng/L量级。如刘伟等【16】 采用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）建立了同时测定运动饮料中 9 种紫外线稳定剂的分析方法，Poiger等【17】用GC-MS建立了瑞士湖泊水体中4种常用紫外线吸收剂的分析方法； Liu等【18】报道了污水处理厂进出口污水中6种紫外线吸收剂的GC-MS/MS分析方法； Zhang等【4】运用液相色谱-质谱联用法建立了沉积物和污水处理厂污泥中5种二苯甲酮类紫外线吸收剂的分析方法； 高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）亦被用于鱼体内有机紫外线吸收剂的检测【5】。
环境介质中有机紫外线吸收剂的通常须经过萃取浓缩以后才能进行仪器分析。常用的固体介质中有机紫外线吸收剂的萃取方法有索氏抽提【11】、加压流体萃取（PLE）【6，10，18】、超声波辅助萃取（USE）【19】和微波辅助萃取（MAE）【9】等。此外，由于环境样品的复杂性，萃取后的样品一般需经净化，降低基质干扰，以提高分析灵敏度和准确性【10】。
已有的研究样品前处理耗时较长、溶剂用量多、操作繁琐，且通常只能分析某一类别几种有机紫外线吸收剂【9】。此外，分析方法大多集中在水体中有机紫外线吸收剂的检测【7，8，15】，而对更为复杂的固体基质，如沉积物中有机紫外线吸收剂的分析方法的报道较少【1】。本研究以我国使用最广泛的有机紫外线吸收剂为目标物，样品经硅胶层析柱分离净化，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测，建立了针对沉积物中5类12种有机紫外线吸收剂的多目标分析方法。目标物定量限多在1～4 pg/g（干重），可用于深入研究有机紫外线吸收剂在环境中的分布及其环境行为。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
TSQ Vantage三重四极杆质谱仪，配有Accela 1250四元泵和Accela自动进样器的液相色谱系统（美国Thermo Fisher公司）； YJ-5200D超声机（中国宁波市鄞州甬杰实验仪器有限公司）； Syncore Polyvap R-12平行蒸发仪（瑞士Buchi公司）； TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）。
分析物和内标：二苯甲酮-3（BP-3，98%）、2-羟基-4-正辛氧基二苯甲酮（UV-531，98%）、对甲氧基肉桂酸辛酯 （EHMC，98%）、4-甲基苄亚基樟脑（4-MBC，98%）、奥克立林（OCR，97%）、对二甲氨基苯甲酸异辛酯（ODPABA，98%）、2-（2′-羟基-3′-叔丁基-5′-甲基苯基）-5-氯苯并三唑（UV-326，98%）、2-2′-羟基-5′-叔辛基苯基）苯并三唑（UV-329，98%）、2-（2′-羟基-3′，5′-二叔丁基苯基）-5-氯代苯并三唑（UV-327，98%）、2-（2′-羟基-3′，5′-二叔戊基苯基）苯并三唑（UV-328，98%）、2-（2′-羟基-5′-甲基苯基）苯并三唑（UV-P，97%）、2-（2H-苯并三唑-2-基）-4，6-二（1-甲基-1-苯基乙基）苯酚（UV-234，98%）和氘代二苯甲酮（BP-d10，98%）购自Sigma-Aldrich公司； 4-MBC-d4（98%C/D/N， 加拿大Isotopes公司。上述化学品的主要物理化学参数以及分子结构见表1。
甲醇和正己烷（德国Merck公司）二氯甲烷（瑞典Oceanpak公司）甲酸和乙酸铵（美国Sigma-Aldrich公司）为色谱纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏集团）。
2.2 标准溶液制备
标准物质及内标化合物在甲醇中配置成10 mg/L储备混合标准液和10 mg/L混合内标溶液。工作混合标准液通过稀释储备混合标准液制得。
2.3 样品采集和处理
在珠江广州河段采集了6个表层沉积物样品（编号为S1，S2，S3，S4，S5和S6），样品用干净的锡箔纸包裹，冷冻干燥后避光保存于
20 ℃备用。
冷冻干燥后的表层沉积物样品经研磨粉碎，过80目筛后得到颗粒均匀的沉积物样品。称取10 g样品于50 mL Nalgene FEP离心管（美国）中，加入混合内标标准溶液至20 ng/g（干重， 下同），混匀。加入20 mL甲醇至离心管中，涡漩混匀后超声波辅助萃取15 min，4000 r/min离心5 min取上清液。萃取过程重复3次，合并所有上清液。上清液减压蒸发至约5 mL，用氮气缓慢吹干， 复溶于1 mL正己烷中。
硅胶（100～200目）在160 ℃下烘烤12 h。取1.5 g已活化的硅胶填于玻璃层析柱（内径0.7 cm）中。用10 mL正己烷润洗硅胶柱后将样品转移至层析柱顶部。用10 mL正己烷淋洗硅胶柱并将该洗脱弃之，然后用15 mL二氯甲烷/甲醇混合溶剂（1∶1， V/V）洗脱目标物。洗脱液在温和的氮气下吹干并定容于1 mL甲醇中，待测。
2.4 色谱质谱条件
2.4.1 色谱条件 ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm），柱前接Phenomenex C18保护柱（4.0 mm×2.0 mm，美国Water公司）。流动相A： 5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸）； 流动相B： 甲醇； 进样量： 5 μL； 流速： 200 μL/min； 柱温： 40 ℃； 梯度洗脱： 0 ～10 min， 50%～20% A； 10～12 min， 20%～10% A； 12～25 min， 10% A； 25～26 min， 10%～50% A； 26～40 min， 50% A。
2.4.2 质谱条件 大气压力化学电离源（APCI）正离子模式； Corona放电电压4.0 μA； APCI汽化器温度350 ℃； 鞘气压力276 kPa； 辅助气压力1.0 MPa； 毛细管温度350 ℃。
3 结果与讨论
3.1 UPLC-MS/MS条件
在流动相中加入适量的醋酸铵可以增强分析物的保留，改善峰形，甲酸则可以提供质子，稳定准分子离子峰，提高分析物的质谱响应【20】。因而，本研究选择5 mmol/L醋酸铵与0.2%甲酸混合溶液和甲醇作为流动相。比较了进样量为5， 10 和20 μL时的色谱分离的效果。进样量为10和20 μL时会造成部分化合物拖尾。所以，进样量定为5 μL。对流动相洗脱梯度进行了优化，使分析物基本上达到了基线分离，如图1所示。
3.5 样品分析
应用该方法初步分析了珠江广州城市河段表层沉积物中有机紫外吸收剂的含量。UV-P， OCR， ODPABA， UV-531， UV-329， UV-326， UV-234和UV-328在所有样品中都存在，含量为0.011～12.0 ng/g。而4-MBC， BP-3和UV 327则仅在个别样品中存在（表5）。珠江河流沉积物中有机紫外吸收剂的分布及其环境行为尚有待进一步研究。
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谢 文， 丁慧瑛， 章晓氡. 分析化学， 2005， 33（12）： 1767-1770
