亲水交互作用—反相二维液相色谱—串联质谱同时测定乳制品中20种抗生素残留
王炼 杨碧霞 张新申 郑洪国 冉良骥
摘 要 建立了亲水作用-反相二维液相色谱-串联质谱测定乳制品中β-内酰胺、四环素、大环内酯、氨基糖苷、酰胺醇、喹诺酮和磺胺7类20种抗生素残留的方法。样品与C18和CN填料混合，进行基质固相分散萃取，以乙腈和水洗脱，洗脱液旋转蒸发至近干，残渣流动相溶解后分析。对样品前处理条件、色谱流动相、质谱参数进行了优化。各分析物回归方程的相关系数为0.9945～0.9998；以定量离子信噪比为3和10时所对应的样品中分析物浓度计算检出限和定量限，分别为0.10～2.40 μg/kg和0.33～7.92 μg/kg。奶粉和牛奶中添加水平25 μg/kg的加标回收率分别为72.5%～97.2%和70.1%～96.8%，相对标准偏差为4.2%～8.8%和3.7%～9.9%。本方法应用于实际样品测定，结果满意。
关键词 亲水交互作用色谱；二维液相色谱；抗生素；基质固相分散
1 引 言
抗生素具有抑制或杀灭细菌、真菌、螺旋体、支原体、衣原体等致病微生物的作用。广义的抗生素常常包括： β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类（Aminoglycosides， AGs）、酰胺醇类、喹诺酮类、磺胺类和多肽类【1，2】。作为常用的兽药，近年来抗生素常被多类混合添加在动物饲料中，以掩盖单个药物残留量超限的现象。因此，为保障食品安全，建立同时检测多类抗生素的方法意义重大。
AGs极性最强，采用反相液相色谱（RPLC）分离，几乎没有保留。在流动相中加入离子对试剂，通过中和电荷降低其极性后可进行RPLC分离，但会极大增加平衡时间，且不利于与质谱联机【3，4】。亲水交互作用色谱（HILIC）使用RPLC的流动相，可分离强极性有机物，能解决了AGs的分离问题【5，6】，且易与质谱联用【7】。由于AGs和其它类抗生素极性差异大，抗生素多残留分析的难点在AGs和其它类同时提取和检测，现有方法通常只涉及4～5类抗生素【8～12】，且AGs和其它类抗生素同时检测的方法鲜有报道。
本研究利用双三元高效液相色谱仪，外接1个可变流速泵，7条流路组成亲水交互作用与反相色谱二维液相色谱系统（HILIC-RPLC），经三段分离，串联质谱（Tandem mass spectrometry， MS/MS）检测，建立了乳制品中的7类20种抗生素同时分离、定性定量分析的方法。对HILIC-RPLC，前人也做过一些研究，但与本方法在目的和原理上有所差异。Jandera等讨论了HILIC与RP的正交性，得出二者不能完全正交的结论【14】；Wang等采用4个流路两段分离模式对12种亲水和13种亲脂的混合物进行了检测，但分析物不涉及抗生素，也未对HILIC和RP都有所保留的情况进行探讨【15】；Liang等则采用了离线HILIC-RPLC的方式【16】。本研究采用了HILIC-RPLC-MS/MS三段检测模式，并提出了混合基质固相分散（Mixed matrix solid phase dispersion， MMSPD）的样品前处理技术，较好地解决了7类抗生素同时提取并检测的难点，方法简便、快速、灵敏度高，满足国际社会食品法规的最大允许残留量要求。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Ultimate3000高效液相色谱仪（美国ThermoFisher公司），带DGP-3600SD泵，带十通阀和六通阀各1个；AXP Auxiliary Pump（美国ThermoFisher公司）；3200Qtrap质谱仪（美国AB Sciex公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士BCHI 公司）；Vortex Genius3型涡旋混匀器（德国IKA公司）；2034型真空泵（美国Welch公司）；VisiprepTM-DL固相萃取系统（美国Sepulco公司）6 mL SPE空管及配套熔融玻璃隔板（美国Agilent公司）；Chromatorex C18键合硅胶填料（40～75 μm，日本富士公司）；Cleanert 氰基（CN），硅胶（Silica），强阳离子（SCX）填料（平均粒度45 μm，美国Agela Technologies）。
头孢噻呋、氨苄青霉素、邻氯青霉素、大观霉素、链霉素、双氢链霉素、庆大霉素C1a、阿米卡星、卡那霉素、恩诺沙星、环丙沙星、替米考星、交沙霉素、强力霉素、土霉素、氯霉素（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；头孢氨苄（Fluka公司）；磺胺甲氧嗪、磺胺氯哒嗪（Sigma公司）；异帕米星（上海士锋生物科技有限公司）。甲醇和乙腈（HPLC级），乙酸铵和甲酸（色谱纯）均购自Dikma公司；EDTA二钠、草酸为分析纯，实验用水为超纯水。1.0 mg/mL标准储备液均用甲醇配制，
20 ℃条件下，头孢氨苄和氨苄青霉素保存14天，其它抗生素保存3个月。
2.2 样品前处理
称取0.50 g奶粉或牛奶样品于研钵中，加入C18和CN填料各0.50 g，加入EDTA二钠1.00 g，用研钵充分碾磨至均匀，装入6 mL SPE空管（底部塞入熔融玻璃隔板）中，另用熔融玻璃隔板于上部将其压至无明显空隙。将装好的SPE管置于固相萃取装置上，用2.5 mL乙腈、2.5 mL水依次清洗研钵两次后，分步加入到SPE管中，减压洗脱（流速控制在3 mL/min以内），收集洗脱液，于（40±1）℃旋转蒸发至近干，加入20 mmol/L乙酸铵-乙腈-甲酸（5∶5∶1）至1.0 mL，涡旋混匀1.0 min后，过0.2 μm水系滤膜，供测定。
2.3 色谱-质谱条件
2.3.1 液相色谱条件 左泵流动相：A为0.2%甲酸，B为乙腈，C为20 mmol/L草酸；右泵流动相：A为20 mmol/L乙酸铵（含0.4%甲酸），B为乙腈（含0.4%甲酸），C为水。AXP泵流动相：水；流速：0.50 mL/min （0.70～1.30 min）、0.20 mL/min（6.50～11.00 min）。色谱柱1：Inspire HILIC， （100 mm ×2.1 mm， 3 μm，Dikma公司）；色谱柱2： Spursil C18-EP（100 mm×2.1 mm， 3 μm，Dikma公司）； 捕获柱（T柱）：Oasis HLB （20 mm×2.1 mm， 25 μm， Waters公司）。柱温：30 ℃。进样体积：10 μL。洗针液：乙腈-水（90∶10， V/V）。阀切换和流动相梯度条件见表1和表2。
2.3.2 质谱条件 气帘气流量： 172.38 Pa； 碰撞气流量： 34.48 Pa； 离子源电压： 3500 V； 接口温度： 550 ℃； 雾化器流量： 344.75 Pa； 辅助加热气流量： 344.75 Pa；检测器电压： 2000 V； 电离模式： ESI+。化合物的母离子、子离子及离子检测参数见表3。
在优化的色谱和质谱条件下，空白奶粉样品添加20种抗生素的混合标准溶液（各分析物浓度均为20 ng/mL）的总离子流图见图1。
3 结果与讨论
3.1 样品前处理条件的优化
基质固相分散（Matrix solid phase dispersion， MSPD）萃取技术使用C8和C18键合硅胶，提取亲脂性化合物，简便快速、提取效率高，常用于动物源性食品中兽药多残留检测的样品前处理中【17】。本方法针对极性强的AGs提出的混合MSPD技术，利用氰基（CN）、C18键合硅胶与EDTA二钠共同组成提取材料，结果表明， 对极性差异大的7类抗生素均有较高的提取效率，能较好的去除样品基质。
实验考察了平均粒度45 μm的氰基（CN）、硅胶（Silica）、强阳离子（SCX）、C18填料和EDTA二钠等提取材料，用奶粉和牛奶的加标回收率考察提取效率。结果表明，如混合提取材料中不含EDTA二钠，强力霉素和土霉素无回收率，这可能与四环素类药物结构中两个酮基易与金属离子形成螯合物造成损失有关。采用SCX或Silica与C18和EDTA二钠组成提取材料时，采用水或乙腈洗脱液，7种AGs均不能被有效洗脱，采用氨化乙腈为洗脱液，可以部分洗脱AGs，仅在使用CN时，奶粉和牛奶中的回收率分别为81.3%（链霉素）～98.3%（环丙沙星），78.4%（链霉素）～97.0%（氯霉素）。这可能与CN填料为硅胶键合氰丙基，同时具备正相和反相保留机制，非极性溶剂溶解待测物并用极性溶剂洗脱时，表现为正相作用，对极性化合物有较好的保留有关，而Silica和SCX对极性化合物保留较强。
3.2 HILIC固定相的选择
已知的HILIC固定相有未衍生化的硅胶【18，19】或杂化颗粒【20，21】、酰胺【22，23】、氨基【24】、二醇【25】、两性离子【26】等。适合AGs分离的固定相有3种：杂化颗粒、未衍生化的硅胶和两性离子。杂化颗粒与未衍生化的硅胶两种固定相保留机理相似，均使用有机相与水相的混合流动相，促使硅醇基团产生，形成带负电的酸性表面，从而有利于阳离子物质的保留，常用来分析碱性极性物质【27】；但硅胶基质颗粒（未衍生化）在中高pH下容易溶解，因此适用范围小于杂化颗粒。两性离子固定相包含摩尔比为1∶1的强碱（季铵）和强酸（磺酸）基团，有利用两性离子固定相对AGs进行分离的报道【28，29】。
本实验比较了未衍生化硅胶的Atlantis HILIC-silica（100 mm×2.1 mm， 3 μm， Waters公司）、两性离子的ZIC-HILIC（50 mm×2.1 mm， 3.5μm， Merck公司）和杂化颗粒硅胶的Inspire HILIC（100 mm×2.1 mm， 3 μm， Dikma公司）的色谱柱，使用Inspire HILIC时， 7种AGs分离良好。ZIC-HILIC柱分析效果不佳的原因，可能与它同时提供带正电和负电荷的官能团，使最终总净电荷接近为零，流动相pH变化对分离影响小有关，在分析带正电的碱性极性化合物时，ZIC-HILIC柱的分离效果不一定优于杂化颗粒。
3.3 三段检测模式的选择
研究发现，HILIC与 RP的分离模式接近于正交【30】。但在实际分离中，所选的20种抗生素中，5种完全不被HILIC柱保留，7种AGs和大环内脂类替米考星在C18柱上几乎不保留，而7种物质在两种色谱柱上均有所保留，而流动相组成和AXP泵流速的变化对这7种物质的影响也不相同。
实验中将20种抗生素分为3组（见表4），第一组为5种在HILIC柱上完全不保留的物质，第二组为7种在HILIC和C18上均有保留的物质，第三组为C18柱不保留的7种AGs和大环内脂类的替米考星，分阶段检测。如图2，状态Ⅰ，20种待测物进入HILIC柱后，第二和第三组物质在HILIC上保留；第一组物质在死时间通过HILIC柱，AXP泵在0.70～1.30 min，引入0.5 mL/min的水用于稀释高比例有机流动相，第一组物质被T柱捕获。状态Ⅱ（1.30～6.50 min），左泵流动相反向将T柱中待测物洗脱至C18柱并分离后，到达检测器。6.50～11.00 min（状态Ⅰ）和11.01～14.00 min（状态Ⅱ），同样方法分离和检测第二组物质，AXP泵流速为0.20 mL/min。14.00～20.00 min（状态Ⅲ），右泵流动相将HILIC上强保留的第三组物质洗脱至质谱检测器分析。
3.4 流动相条件优化
3.4.1 左泵流动相
对第一组物质，使用乙腈和0.2%甲酸水溶液流动相，分离良好且质谱响应度高。第二组中四环素类的强力霉素和土霉素，特有的两个酮基结构使之易与硅羟基作用，分离时出现明显拖尾峰。研究表明，流动相中加入草酸【31】、琥珀酸【32】、柠檬酸【33】 等螯合剂可改善分离。本实验中，流动相中加入草酸，结果表明，强力霉素和土霉素峰形得到极大改善；但草酸浓度太高会对其它物质峰形和分离带来很大影响。实验采用了11.01～11.20 min， 0.2%甲酸-乙腈（5∶95， V/V）反向冲洗T柱，防止峰展宽；11.21～12.70 min，乙腈-20 mmol/L草酸（5∶95， V/V）保证了足够的螯合剂，防止了强力霉素和土霉素的拖尾；12.71～14.00 min，0.2%甲酸-乙腈梯度变化，使第二组7种物质峰形良好。
3.4.2 右泵流动相
实验表明，在将第一组物质（0～1.30 min）和第二组物质（6.50～11.00 min）洗脱至T柱阶段，需分别使用高比例的有机相（95%和 90%），才能将两组物质有效洗脱至T柱，并确保第三组物质不被冲出HILIC柱。这可能与两组物质极性较弱以及HILIC柱保留强极性物质时，乙腈是弱洗脱溶剂有关。
3.4.3 AXP泵条件 AXP泵开启时间及流速在一定程度上影响分离，系统死时间为0.70 min，AXP泵开启过早或流速过大，产生的反压会通过三通影响到HILIC柱的分离，使第一组物质无法顺利通过三通进入T柱。比较4种流速（0， 0.25， 0.50和0.75 mL/min）的实验表明，AXP泵流速死时间（0.70min）后开启，保持0.50 mL/min流速时，综合效果最佳。
采用同样方法优化AXP泵在第二组物质分离时的条件，结果表明，AXP泵开启6.50～11.00 min，流速：0.20 mL/min，第二组物质分离良好。
在优化色谱和质谱条件下，8种代表性的抗生素多反应监测色谱图如图3所示。
3.5 方法学评价
对空白奶粉分别添加1.0 mL待测物浓度分别为0.2， 0.5， 2.0， 5.0， 20和100 ng/mL混合标准溶液，按2.2节进行样品前处理后，在优化的色谱和质谱条件下测定，对各待测物浓度和定量离子峰面积进行线性回归。根据定量离子信噪比（S/N）分别为3和10时对应的样品中待测物浓度，得到检出限和定量限（表4）。
在奶粉和牛奶中添加0.5， 1.0， 1.5倍最大残留限量（MRL）的各抗生素（以MRL值最小的头孢族抗生素50 μg/kg为基准），即25， 50和75 μg/kg3个水平，平行测定6份。
计算奶粉和牛奶中平均加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果：25 μg/kg水平，回收率分别为72.5%（强力霉素）～97.2%（环丙沙星）和70.1%（强力霉素）～96.8%（环丙沙星），RSD分别为4.2%（替米考星）～8.8%（四环素）和3.7%（替米考星）～9.9%（四环素）；50 μg/kg水平，回收率分别为77.0%（强力霉素）～102.1%（环丙沙星）和76.4%（四环素）～98.9%（环丙沙星），RSD分别为2.8%（卡那霉素）～6.9%（四环素）和4.0%（氯霉素）～7.8%（四环素）； 75 μg/kg水平，回收率分别为82.4%（四环素）～104.7%（恩诺沙星）和79.0%（四环素）～105.8%（环丙沙星），RSD分别为3.6%
3.6 实际样品的分析
对市售的5份奶粉、5份牛奶、5份原奶进行检测，在1份原奶中检出氨苄青霉素，含量37.6 μg/kg，低于欧盟规定的MRL（50 μg/kg），阳性样品的总离子流图和二级质谱图见图4。
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AGs极性最强，采用反相液相色谱（RPLC）分离，几乎没有保留。在流动相中加入离子对试剂，通过中和电荷降低其极性后可进行RPLC分离，但会极大增加平衡时间，且不利于与质谱联机【3，4】。亲水交互作用色谱（HILIC）使用RPLC的流动相，可分离强极性有机物，能解决了AGs的分离问题【5，6】，且易与质谱联用【7】。由于AGs和其它类抗生素极性差异大，抗生素多残留分析的难点在AGs和其它类同时提取和检测，现有方法通常只涉及4～5类抗生素【8～12】，且AGs和其它类抗生素同时检测的方法鲜有报道。
本研究利用双三元高效液相色谱仪，外接1个可变流速泵，7条流路组成亲水交互作用与反相色谱二维液相色谱系统（HILIC-RPLC），经三段分离，串联质谱（Tandem mass spectrometry， MS/MS）检测，建立了乳制品中的7类20种抗生素同时分离、定性定量分析的方法。对HILIC-RPLC，前人也做过一些研究，但与本方法在目的和原理上有所差异。Jandera等讨论了HILIC与RP的正交性，得出二者不能完全正交的结论【14】；Wang等采用4个流路两段分离模式对12种亲水和13种亲脂的混合物进行了检测，但分析物不涉及抗生素，也未对HILIC和RP都有所保留的情况进行探讨【15】；Liang等则采用了离线HILIC-RPLC的方式【16】。本研究采用了HILIC-RPLC-MS/MS三段检测模式，并提出了混合基质固相分散（Mixed matrix solid phase dispersion， MMSPD）的样品前处理技术，较好地解决了7类抗生素同时提取并检测的难点，方法简便、快速、灵敏度高，满足国际社会食品法规的最大允许残留量要求。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Ultimate3000高效液相色谱仪（美国ThermoFisher公司），带DGP-3600SD泵，带十通阀和六通阀各1个；AXP Auxiliary Pump（美国ThermoFisher公司）；3200Qtrap质谱仪（美国AB Sciex公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士BCHI 公司）；Vortex Genius3型涡旋混匀器（德国IKA公司）；2034型真空泵（美国Welch公司）；VisiprepTM-DL固相萃取系统（美国Sepulco公司）6 mL SPE空管及配套熔融玻璃隔板（美国Agilent公司）；Chromatorex C18键合硅胶填料（40～75 μm，日本富士公司）；Cleanert 氰基（CN），硅胶（Silica），强阳离子（SCX）填料（平均粒度45 μm，美国Agela Technologies）。
头孢噻呋、氨苄青霉素、邻氯青霉素、大观霉素、链霉素、双氢链霉素、庆大霉素C1a、阿米卡星、卡那霉素、恩诺沙星、环丙沙星、替米考星、交沙霉素、强力霉素、土霉素、氯霉素（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；头孢氨苄（Fluka公司）；磺胺甲氧嗪、磺胺氯哒嗪（Sigma公司）；异帕米星（上海士锋生物科技有限公司）。甲醇和乙腈（HPLC级），乙酸铵和甲酸（色谱纯）均购自Dikma公司；EDTA二钠、草酸为分析纯，实验用水为超纯水。1.0 mg/mL标准储备液均用甲醇配制，
20 ℃条件下，头孢氨苄和氨苄青霉素保存14天，其它抗生素保存3个月。
2.2 样品前处理
称取0.50 g奶粉或牛奶样品于研钵中，加入C18和CN填料各0.50 g，加入EDTA二钠1.00 g，用研钵充分碾磨至均匀，装入6 mL SPE空管（底部塞入熔融玻璃隔板）中，另用熔融玻璃隔板于上部将其压至无明显空隙。将装好的SPE管置于固相萃取装置上，用2.5 mL乙腈、2.5 mL水依次清洗研钵两次后，分步加入到SPE管中，减压洗脱（流速控制在3 mL/min以内），收集洗脱液，于（40±1）℃旋转蒸发至近干，加入20 mmol/L乙酸铵-乙腈-甲酸（5∶5∶1）至1.0 mL，涡旋混匀1.0 min后，过0.2 μm水系滤膜，供测定。
2.3 色谱-质谱条件
2.3.1 液相色谱条件 左泵流动相：A为0.2%甲酸，B为乙腈，C为20 mmol/L草酸；右泵流动相：A为20 mmol/L乙酸铵（含0.4%甲酸），B为乙腈（含0.4%甲酸），C为水。AXP泵流动相：水；流速：0.50 mL/min （0.70～1.30 min）、0.20 mL/min（6.50～11.00 min）。色谱柱1：Inspire HILIC， （100 mm ×2.1 mm， 3 μm，Dikma公司）；色谱柱2： Spursil C18-EP（100 mm×2.1 mm， 3 μm，Dikma公司）； 捕获柱（T柱）：Oasis HLB （20 mm×2.1 mm， 25 μm， Waters公司）。柱温：30 ℃。进样体积：10 μL。洗针液：乙腈-水（90∶10， V/V）。阀切换和流动相梯度条件见表1和表2。
2.3.2 质谱条件 气帘气流量： 172.38 Pa； 碰撞气流量： 34.48 Pa； 离子源电压： 3500 V； 接口温度： 550 ℃； 雾化器流量： 344.75 Pa； 辅助加热气流量： 344.75 Pa；检测器电压： 2000 V； 电离模式： ESI+。化合物的母离子、子离子及离子检测参数见表3。
在优化的色谱和质谱条件下，空白奶粉样品添加20种抗生素的混合标准溶液（各分析物浓度均为20 ng/mL）的总离子流图见图1。
3 结果与讨论
3.1 样品前处理条件的优化
基质固相分散（Matrix solid phase dispersion， MSPD）萃取技术使用C8和C18键合硅胶，提取亲脂性化合物，简便快速、提取效率高，常用于动物源性食品中兽药多残留检测的样品前处理中【17】。本方法针对极性强的AGs提出的混合MSPD技术，利用氰基（CN）、C18键合硅胶与EDTA二钠共同组成提取材料，结果表明， 对极性差异大的7类抗生素均有较高的提取效率，能较好的去除样品基质。
实验考察了平均粒度45 μm的氰基（CN）、硅胶（Silica）、强阳离子（SCX）、C18填料和EDTA二钠等提取材料，用奶粉和牛奶的加标回收率考察提取效率。结果表明，如混合提取材料中不含EDTA二钠，强力霉素和土霉素无回收率，这可能与四环素类药物结构中两个酮基易与金属离子形成螯合物造成损失有关。采用SCX或Silica与C18和EDTA二钠组成提取材料时，采用水或乙腈洗脱液，7种AGs均不能被有效洗脱，采用氨化乙腈为洗脱液，可以部分洗脱AGs，仅在使用CN时，奶粉和牛奶中的回收率分别为81.3%（链霉素）～98.3%（环丙沙星），78.4%（链霉素）～97.0%（氯霉素）。这可能与CN填料为硅胶键合氰丙基，同时具备正相和反相保留机制，非极性溶剂溶解待测物并用极性溶剂洗脱时，表现为正相作用，对极性化合物有较好的保留有关，而Silica和SCX对极性化合物保留较强。
3.2 HILIC固定相的选择
已知的HILIC固定相有未衍生化的硅胶【18，19】或杂化颗粒【20，21】、酰胺【22，23】、氨基【24】、二醇【25】、两性离子【26】等。适合AGs分离的固定相有3种：杂化颗粒、未衍生化的硅胶和两性离子。杂化颗粒与未衍生化的硅胶两种固定相保留机理相似，均使用有机相与水相的混合流动相，促使硅醇基团产生，形成带负电的酸性表面，从而有利于阳离子物质的保留，常用来分析碱性极性物质【27】；但硅胶基质颗粒（未衍生化）在中高pH下容易溶解，因此适用范围小于杂化颗粒。两性离子固定相包含摩尔比为1∶1的强碱（季铵）和强酸（磺酸）基团，有利用两性离子固定相对AGs进行分离的报道【28，29】。
本实验比较了未衍生化硅胶的Atlantis HILIC-silica（100 mm×2.1 mm， 3 μm， Waters公司）、两性离子的ZIC-HILIC（50 mm×2.1 mm， 3.5μm， Merck公司）和杂化颗粒硅胶的Inspire HILIC（100 mm×2.1 mm， 3 μm， Dikma公司）的色谱柱，使用Inspire HILIC时， 7种AGs分离良好。ZIC-HILIC柱分析效果不佳的原因，可能与它同时提供带正电和负电荷的官能团，使最终总净电荷接近为零，流动相pH变化对分离影响小有关，在分析带正电的碱性极性化合物时，ZIC-HILIC柱的分离效果不一定优于杂化颗粒。
3.3 三段检测模式的选择
研究发现，HILIC与 RP的分离模式接近于正交【30】。但在实际分离中，所选的20种抗生素中，5种完全不被HILIC柱保留，7种AGs和大环内脂类替米考星在C18柱上几乎不保留，而7种物质在两种色谱柱上均有所保留，而流动相组成和AXP泵流速的变化对这7种物质的影响也不相同。
实验中将20种抗生素分为3组（见表4），第一组为5种在HILIC柱上完全不保留的物质，第二组为7种在HILIC和C18上均有保留的物质，第三组为C18柱不保留的7种AGs和大环内脂类的替米考星，分阶段检测。如图2，状态Ⅰ，20种待测物进入HILIC柱后，第二和第三组物质在HILIC上保留；第一组物质在死时间通过HILIC柱，AXP泵在0.70～1.30 min，引入0.5 mL/min的水用于稀释高比例有机流动相，第一组物质被T柱捕获。状态Ⅱ（1.30～6.50 min），左泵流动相反向将T柱中待测物洗脱至C18柱并分离后，到达检测器。6.50～11.00 min（状态Ⅰ）和11.01～14.00 min（状态Ⅱ），同样方法分离和检测第二组物质，AXP泵流速为0.20 mL/min。14.00～20.00 min（状态Ⅲ），右泵流动相将HILIC上强保留的第三组物质洗脱至质谱检测器分析。
3.4 流动相条件优化
3.4.1 左泵流动相
对第一组物质，使用乙腈和0.2%甲酸水溶液流动相，分离良好且质谱响应度高。第二组中四环素类的强力霉素和土霉素，特有的两个酮基结构使之易与硅羟基作用，分离时出现明显拖尾峰。研究表明，流动相中加入草酸【31】、琥珀酸【32】、柠檬酸【33】 等螯合剂可改善分离。本实验中，流动相中加入草酸，结果表明，强力霉素和土霉素峰形得到极大改善；但草酸浓度太高会对其它物质峰形和分离带来很大影响。实验采用了11.01～11.20 min， 0.2%甲酸-乙腈（5∶95， V/V）反向冲洗T柱，防止峰展宽；11.21～12.70 min，乙腈-20 mmol/L草酸（5∶95， V/V）保证了足够的螯合剂，防止了强力霉素和土霉素的拖尾；12.71～14.00 min，0.2%甲酸-乙腈梯度变化，使第二组7种物质峰形良好。
3.4.2 右泵流动相
实验表明，在将第一组物质（0～1.30 min）和第二组物质（6.50～11.00 min）洗脱至T柱阶段，需分别使用高比例的有机相（95%和 90%），才能将两组物质有效洗脱至T柱，并确保第三组物质不被冲出HILIC柱。这可能与两组物质极性较弱以及HILIC柱保留强极性物质时，乙腈是弱洗脱溶剂有关。
3.4.3 AXP泵条件 AXP泵开启时间及流速在一定程度上影响分离，系统死时间为0.70 min，AXP泵开启过早或流速过大，产生的反压会通过三通影响到HILIC柱的分离，使第一组物质无法顺利通过三通进入T柱。比较4种流速（0， 0.25， 0.50和0.75 mL/min）的实验表明，AXP泵流速死时间（0.70min）后开启，保持0.50 mL/min流速时，综合效果最佳。
采用同样方法优化AXP泵在第二组物质分离时的条件，结果表明，AXP泵开启6.50～11.00 min，流速：0.20 mL/min，第二组物质分离良好。
在优化色谱和质谱条件下，8种代表性的抗生素多反应监测色谱图如图3所示。
3.5 方法学评价
对空白奶粉分别添加1.0 mL待测物浓度分别为0.2， 0.5， 2.0， 5.0， 20和100 ng/mL混合标准溶液，按2.2节进行样品前处理后，在优化的色谱和质谱条件下测定，对各待测物浓度和定量离子峰面积进行线性回归。根据定量离子信噪比（S/N）分别为3和10时对应的样品中待测物浓度，得到检出限和定量限（表4）。
在奶粉和牛奶中添加0.5， 1.0， 1.5倍最大残留限量（MRL）的各抗生素（以MRL值最小的头孢族抗生素50 μg/kg为基准），即25， 50和75 μg/kg3个水平，平行测定6份。
计算奶粉和牛奶中平均加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果：25 μg/kg水平，回收率分别为72.5%（强力霉素）～97.2%（环丙沙星）和70.1%（强力霉素）～96.8%（环丙沙星），RSD分别为4.2%（替米考星）～8.8%（四环素）和3.7%（替米考星）～9.9%（四环素）；50 μg/kg水平，回收率分别为77.0%（强力霉素）～102.1%（环丙沙星）和76.4%（四环素）～98.9%（环丙沙星），RSD分别为2.8%（卡那霉素）～6.9%（四环素）和4.0%（氯霉素）～7.8%（四环素）； 75 μg/kg水平，回收率分别为82.4%（四环素）～104.7%（恩诺沙星）和79.0%（四环素）～105.8%（环丙沙星），RSD分别为3.6%
3.6 实际样品的分析
对市售的5份奶粉、5份牛奶、5份原奶进行检测，在1份原奶中检出氨苄青霉素，含量37.6 μg/kg，低于欧盟规定的MRL（50 μg/kg），阳性样品的总离子流图和二级质谱图见图4。
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