基质固相分散—气相色谱串联质谱法测定孕妇血清中22种持久性有机污染物
赵鹏+施家威+李继革+徐奋奋+龚文杰+裘立晓
摘 要 建立了基质固相分散技术-气相色谱串联质谱法（MSPD-GC-QQQ-MS/MS）同时测定孕妇血清中22种持久性有机污染物（艾氏剂、狄氏剂、七氯、灭蚁灵、六六六、多氯联苯和滴滴涕）的方法。血清样品与C18吸附剂混合净化，正己烷溶液洗脱，GC-QQQ-MS/MS测定。采用Agilent J&W DB-35ms（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm）分离，正电子离子源（EI+）模式电离，多反应监测模式（MRM）下进行测定，外标法定量。结果表明，在1.0～1000.0 ng/mL的范围内，22种持久性有机污染物的相关系数均大于0.99；在2.0和20.0 ng/mL的添加水平下，所有持久性有机污染物回收率均在75%～115%之间，方法定量限均≤0.15 ng/mL。在比较基质固相分散（MSPD）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）提取和净化实际加标血清样品时，MSPD方法的结果中位数更接近真实值，且离散程度最小。本方法适用于人类血清中多种持久性有机物的定性和定量分析。
关键词 基质固相分散技术； 气相色谱串联质谱； 持久性有机污染物； 血清
1 引 言
持久性有机污染物（Persistent organic pollutants， POPs）是一类半挥发性有机物质，它之所以被广泛关注是由于其具有高毒性、持久性、易于生物积累并可以长距离转移 【1】。早在2005年斯德哥尔摩公约中明确规定了首批消除的12类持久性有机污染物（艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂、滴滴涕、七氯、氯丹、灭蚁灵、毒杀芬、六氯苯、多氯联苯、二噁英和呋喃），由于持久性有机污染物可以通过食物链最终累积于人体，并对神经系统、免疫系统以及生育系统造成损伤【2】。因此，对持久性有机污染物的监测是一项长久且必要的工作。
目前，国际上监测人体中持久性有机污染物普遍以血清总脂（Total serum lipid， ng/g lipids）为计量单位。这是因为持久性有机污染物具有亲脂性，其含量与血清中的脂含量密切相关【3】。另外，有学者在分析人体血液中有机氯农药残留时，发现当使用体积基准（ng/mL）时，空腹与否对血清中有机氯农药的水平是有影响的，因此使用血清总脂作为计量单位则使得结果更稳定，且更具可比性【4】。
生物组织中持久性有机污染物的提取和净化方法有很多，目前比较常见的有超声破碎提取法【5】、微波辅助提取法（MAE）【6，7】、液液萃取法（LLE）【8，9】、固相萃取法（SPE）【10，11】等，其中基质固相分散提取法（MSPD）以其简便、高效、安全、价格低廉的特点被广泛用于持久性有机污染物的提取和净化中【12～14】，它直接利用基质固相分散技术去除待测样品中的潜在干扰物，所得洗脱液即可直接用于质谱分析。
本研究基于基质固相分散提取（MSPD）的原理，建立适合提取孕妇血清中22种持久性有机污染物的基质固相分散提取法，然后使用GC-QQQ-MS/MS对持久性有机污染物进行定性定量分析，从而为研究区域人群中持久性有机污染物的分布特点提供技术支持。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 7890A气相色谱仪（Palo Alto， CA），7000B三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent 公司）； 固相萃取装置（美国Agilent 公司）； HGC-24氮吹仪（天津恒奥公司）； Milli-Q 纯水发生器（美国Millipore 公司）； 高速离心机（上海安亭公司）。
C18吸附剂（50 μm， 美国Agilent公司）； 正己烷、甲醇和丙酮（色谱级，美国TEDIA公司）； ProElut Na2SO4 固相萃取柱（6 mL， 1000 mg， 美国DIKMA公司）； 多氯联苯（PCB 28， PCB 30， PCB 52， PCB 73， PCB 101， PCB 118， PCB 138， PCB 153， PCB 155， PCB 180 和PCB 204）购于Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于99%； 六六六（HCH-α， β， γ，ε）、艾氏剂（Aldrin）、狄氏剂（Dieldrin）、灭蚁灵（Mirex）、七氯（Heptachlor）、滴滴涕（p，p′-DDE ； p，p′-DDD； p， p′-DDT）均购于农业环境保护研究所（100 mg/L， 中国天津）。
2.2 标准溶液配制
准确称取11 种多氯联苯标准品各1.0 mg 于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配成浓度为100 mg/L的标准储备液，于
18 ℃密封保存。分别吸取22种持久性有机污染物各50 μL 于5.0 mL棕色容量瓶中，正己烷定容，配制成混和标准储备溶液，于4 ℃密封保存，待用。
2.3 色谱条件和质谱条件
色谱： Agilent J&W DB-35ms 色谱柱（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm），程序升温： 初始温度70 ℃，保持2 min，然后以20 ℃/min升温至180 ℃，再以10 ℃/min升温至280 ℃并保持5 min； 进样口温度：260 ℃，进样口压力：195.39 kPa （氦气， 99.999%），恒压模式，采用不分流模式，加标血清样品色谱图及某孕妇血清样品图谱见图1。
称取1.0 g C18吸附剂置于玻璃研钵中，加入0.5 mL甲醇碾磨、活化C18吸附剂。然后吸取0.5 mL 血清样品于研钵中，用玻璃棒将血清与活化的C18吸附剂碾磨混合均匀，并将得到的匀质物填入空柱，使用6 mL 5%丙酮-水溶液清洗并抽干，之后将ProElut Na2SO4固相萃取柱与上述自制小柱连接，最后用4 mL正己烷将目标化合物洗脱，洗脱液在50 ℃条件下，氮气吹干，使用200 μL正己烷溶解残留物，待测。
2.5 血清总脂的计算
血清总脂（TSL）一般可由甘油三酯（Tg）和胆固醇（TC）计算获得 ＼表2 22种持久性有机污染物线性关系以及方法回收率和定量限
3.4 MSPD， LLE和SPE方法应用的比较
为了比较MSPD、LLE和SPE 3种方法在检测血清中持久性有机污染物的应用， 分别采用本研究建立的基质固相分散（MSPD）-气相色谱串联质谱法、Yao等【17】建立的液-液萃取-气相色谱串联质谱法和Bergonzi等【10】建立的固相萃取（SPE）-气相色谱串联质谱法开展加标回收率实验和精密度实验。以实际血清样本中所添加上述11种多氯联苯为例，经计算加标∑PCBs（ng/mg lipid）的真实值为3.482 ng/mg lipid。通过比较3种方法计算所获得的中位数，本方法所得数值与真实值最接近，且数据离散程度最小。图3显示3种方法测得加标样品中∑PCBs（ng/mg lipid）均小于真实值，另外，加标回收和精密度的实验结果显示。
图3 采用3种检测方法计算所得∑PCBs（ng/mg lipid， n=5）的分布情况
Fig.3 Distribution of ∑PCBs mean concentrations （ng/mg lipid， n=5） with the three methods
每个箱图中三角形代表各自的中位数，箱体上下两端代表25%和75%百分位数，直线标注为真实值。
Each box shows the median as a triangle， the 25th and 75th percentiles as a box. The straight line marks the actual concentration.
本方法和Bergonzi等【10】采用的方法测得的22种持久性有机污染物回收率分别为76.1%～114.1%和74.3%～122.2%，精密度分别为4.3%～12.6%和5.1%～17.6%，Yao等【17】 采用的方法（液-液萃取-气相色谱串联质谱法）运用于加标血清检测时部分多氯联苯和六六六单体回收率几乎为零。综上所述，本方法与上述液液萃取和固相萃取相比，克服了冗长的耗时和大量试剂的耗费，并且通过破坏复杂生物样本结构，增加生物样本与吸附材料的接触表面积，促使固相吸附材料与生物样本产生相互作用力，从而实现目标化合物的高效提取和分离【13】。
3.5 实际样品分析
对38份孕妇血清样品进行分析，每份样品平行测定3次，其中艾氏剂、狄氏剂、灭蚁灵和滴滴涕在此次检测中均未检出（见表3）。32份孕妇血清样品中检出有β-HCH或PCBs单体，其中β-HCH平均浓度为474 ng/g lipid，低于Masuda等【18】在日本调查的结果（564 ng/g lipid）； 而∑PCBs的平均浓度为118 ng/g lipid，低于Voorspoels等【19】在比利时的调查结果（237 ng/g lipid），但高于Tan等【2】在新加坡的调查结果（29 ng/g lipid）。
References
1 de Boer J. Anal. Lett.， 2012， 45（5-6）： 485-494
2 Tan J，Loganath A， Chong Y S， Obbard J P. Toxico. Enviro. Chem.， 2008， 90（5）： 837-859
3 Haddad S，Poulin P， Krishnan K. Chemosphere， 2000， 40（8）： 839-843
4 Phillips D L， Pirke J L， Burse V W， Bernert Jr J T， Omar Henderson L， Needham L L. Arch. Environ. Contam. Toxicol.， 1989， 18（4）： 495-500
5 Jacobs M N，Covaci A， Gheorghe A， Schepens P. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（6）： 1780-1788
6 Wang P， Zhang Q， Wang Y， Wang T， Li X. Anal. Chim. Acta， 2010， 663（1）： 43-48
7 Tapie N， Budzinski H， Le Ménach K. Anal. Bioanal. Chem.， 2008， 391（6）： 2169-2177
8 PanM， Ma X D， Song S L， Zhang J X， Liu C， Guo X C. Anal. Lett.， 2014， 47（13）： 2173-2182
9 SONG Shu-Ling， HU Xiao-Jian， QI Peng， LI Song， TONG Ling， TIAN Qin， MA Xiao-Dong. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（1）： 49-54
宋淑玲， 胡小健， 祁 鹏， 李 松， 佟 玲， 田 芹， 马晓东. 分析化学， 2015， 43（1）： 49-54
10 Bergonzi R， De Palma G， Tomasi C， Ricossa M C， Apostoli P. Int. Arch. Occup. Environ. Health， 2009， 82（10）： 1241-1247
11 Orta-García S， Pérez-Vzquez F， Gonzlez-Vega C， Varela-Silva J A， Hernndez-Gonzlez L， Pérez-Maldonado I. Sci. Total Environ.， 2014， 472： 496～501. doi：10.1016/j.scitotenv. 2013.11.059
12 Labadie P， Alliot F， Bourges C， Desportes A， Chevreuil M. Anal. Chim. Acta， 2010， 675（2）： 97-105
13 Barker S A. J. Biochem. Bioph. Meth.， 2007， 70（2）： 151-162
14 Fidalgo-Used N， Blanco-Gonzlez E， Sanz-Medel A. Anal. Chim. Acta， 2007， 590（1）： 1-16
15 CHEN Xiao-Hua. Technology and Application of Solid Phase Extraction. Beijing： Science Press， 2010： 253
陈小华. 固相萃取技术与应用. 北京： 科学出版社， 2010： 253
16 Silva M G D， Aquino A， Dorea H S， Navickiene S. Talanta， 2008， 76（3）： 680-684
17 Yao Z， Zhang Y， Jiang G. Bull. Environ. Contam. Tox.， 2005， 74（1）： 155-161
18 Masuda Y，Haraguchi K， Kono S， Tsuji H， Papke O. Chemosphere， 2005， 58（3）： 329-344
19 Voorspoels S， Covaci A， Maervoet J， Schepens P. B. Environ. Contam. Tox.， 2002， 69（1）： 22-29
摘 要 建立了基质固相分散技术-气相色谱串联质谱法（MSPD-GC-QQQ-MS/MS）同时测定孕妇血清中22种持久性有机污染物（艾氏剂、狄氏剂、七氯、灭蚁灵、六六六、多氯联苯和滴滴涕）的方法。血清样品与C18吸附剂混合净化，正己烷溶液洗脱，GC-QQQ-MS/MS测定。采用Agilent J&W DB-35ms（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm）分离，正电子离子源（EI+）模式电离，多反应监测模式（MRM）下进行测定，外标法定量。结果表明，在1.0～1000.0 ng/mL的范围内，22种持久性有机污染物的相关系数均大于0.99；在2.0和20.0 ng/mL的添加水平下，所有持久性有机污染物回收率均在75%～115%之间，方法定量限均≤0.15 ng/mL。在比较基质固相分散（MSPD）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）提取和净化实际加标血清样品时，MSPD方法的结果中位数更接近真实值，且离散程度最小。本方法适用于人类血清中多种持久性有机物的定性和定量分析。
关键词 基质固相分散技术； 气相色谱串联质谱； 持久性有机污染物； 血清
1 引 言
持久性有机污染物（Persistent organic pollutants， POPs）是一类半挥发性有机物质，它之所以被广泛关注是由于其具有高毒性、持久性、易于生物积累并可以长距离转移 【1】。早在2005年斯德哥尔摩公约中明确规定了首批消除的12类持久性有机污染物（艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂、滴滴涕、七氯、氯丹、灭蚁灵、毒杀芬、六氯苯、多氯联苯、二噁英和呋喃），由于持久性有机污染物可以通过食物链最终累积于人体，并对神经系统、免疫系统以及生育系统造成损伤【2】。因此，对持久性有机污染物的监测是一项长久且必要的工作。
目前，国际上监测人体中持久性有机污染物普遍以血清总脂（Total serum lipid， ng/g lipids）为计量单位。这是因为持久性有机污染物具有亲脂性，其含量与血清中的脂含量密切相关【3】。另外，有学者在分析人体血液中有机氯农药残留时，发现当使用体积基准（ng/mL）时，空腹与否对血清中有机氯农药的水平是有影响的，因此使用血清总脂作为计量单位则使得结果更稳定，且更具可比性【4】。
生物组织中持久性有机污染物的提取和净化方法有很多，目前比较常见的有超声破碎提取法【5】、微波辅助提取法（MAE）【6，7】、液液萃取法（LLE）【8，9】、固相萃取法（SPE）【10，11】等，其中基质固相分散提取法（MSPD）以其简便、高效、安全、价格低廉的特点被广泛用于持久性有机污染物的提取和净化中【12～14】，它直接利用基质固相分散技术去除待测样品中的潜在干扰物，所得洗脱液即可直接用于质谱分析。
本研究基于基质固相分散提取（MSPD）的原理，建立适合提取孕妇血清中22种持久性有机污染物的基质固相分散提取法，然后使用GC-QQQ-MS/MS对持久性有机污染物进行定性定量分析，从而为研究区域人群中持久性有机污染物的分布特点提供技术支持。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 7890A气相色谱仪（Palo Alto， CA），7000B三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent 公司）； 固相萃取装置（美国Agilent 公司）； HGC-24氮吹仪（天津恒奥公司）； Milli-Q 纯水发生器（美国Millipore 公司）； 高速离心机（上海安亭公司）。
C18吸附剂（50 μm， 美国Agilent公司）； 正己烷、甲醇和丙酮（色谱级，美国TEDIA公司）； ProElut Na2SO4 固相萃取柱（6 mL， 1000 mg， 美国DIKMA公司）； 多氯联苯（PCB 28， PCB 30， PCB 52， PCB 73， PCB 101， PCB 118， PCB 138， PCB 153， PCB 155， PCB 180 和PCB 204）购于Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于99%； 六六六（HCH-α， β， γ，ε）、艾氏剂（Aldrin）、狄氏剂（Dieldrin）、灭蚁灵（Mirex）、七氯（Heptachlor）、滴滴涕（p，p′-DDE ； p，p′-DDD； p， p′-DDT）均购于农业环境保护研究所（100 mg/L， 中国天津）。
2.2 标准溶液配制
准确称取11 种多氯联苯标准品各1.0 mg 于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配成浓度为100 mg/L的标准储备液，于
18 ℃密封保存。分别吸取22种持久性有机污染物各50 μL 于5.0 mL棕色容量瓶中，正己烷定容，配制成混和标准储备溶液，于4 ℃密封保存，待用。
2.3 色谱条件和质谱条件
色谱： Agilent J&W DB-35ms 色谱柱（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm），程序升温： 初始温度70 ℃，保持2 min，然后以20 ℃/min升温至180 ℃，再以10 ℃/min升温至280 ℃并保持5 min； 进样口温度：260 ℃，进样口压力：195.39 kPa （氦气， 99.999%），恒压模式，采用不分流模式，加标血清样品色谱图及某孕妇血清样品图谱见图1。
称取1.0 g C18吸附剂置于玻璃研钵中，加入0.5 mL甲醇碾磨、活化C18吸附剂。然后吸取0.5 mL 血清样品于研钵中，用玻璃棒将血清与活化的C18吸附剂碾磨混合均匀，并将得到的匀质物填入空柱，使用6 mL 5%丙酮-水溶液清洗并抽干，之后将ProElut Na2SO4固相萃取柱与上述自制小柱连接，最后用4 mL正己烷将目标化合物洗脱，洗脱液在50 ℃条件下，氮气吹干，使用200 μL正己烷溶解残留物，待测。
2.5 血清总脂的计算
血清总脂（TSL）一般可由甘油三酯（Tg）和胆固醇（TC）计算获得 ＼表2 22种持久性有机污染物线性关系以及方法回收率和定量限
3.4 MSPD， LLE和SPE方法应用的比较
为了比较MSPD、LLE和SPE 3种方法在检测血清中持久性有机污染物的应用， 分别采用本研究建立的基质固相分散（MSPD）-气相色谱串联质谱法、Yao等【17】建立的液-液萃取-气相色谱串联质谱法和Bergonzi等【10】建立的固相萃取（SPE）-气相色谱串联质谱法开展加标回收率实验和精密度实验。以实际血清样本中所添加上述11种多氯联苯为例，经计算加标∑PCBs（ng/mg lipid）的真实值为3.482 ng/mg lipid。通过比较3种方法计算所获得的中位数，本方法所得数值与真实值最接近，且数据离散程度最小。图3显示3种方法测得加标样品中∑PCBs（ng/mg lipid）均小于真实值，另外，加标回收和精密度的实验结果显示。
图3 采用3种检测方法计算所得∑PCBs（ng/mg lipid， n=5）的分布情况
Fig.3 Distribution of ∑PCBs mean concentrations （ng/mg lipid， n=5） with the three methods
每个箱图中三角形代表各自的中位数，箱体上下两端代表25%和75%百分位数，直线标注为真实值。
Each box shows the median as a triangle， the 25th and 75th percentiles as a box. The straight line marks the actual concentration.
本方法和Bergonzi等【10】采用的方法测得的22种持久性有机污染物回收率分别为76.1%～114.1%和74.3%～122.2%，精密度分别为4.3%～12.6%和5.1%～17.6%，Yao等【17】 采用的方法（液-液萃取-气相色谱串联质谱法）运用于加标血清检测时部分多氯联苯和六六六单体回收率几乎为零。综上所述，本方法与上述液液萃取和固相萃取相比，克服了冗长的耗时和大量试剂的耗费，并且通过破坏复杂生物样本结构，增加生物样本与吸附材料的接触表面积，促使固相吸附材料与生物样本产生相互作用力，从而实现目标化合物的高效提取和分离【13】。
3.5 实际样品分析
对38份孕妇血清样品进行分析，每份样品平行测定3次，其中艾氏剂、狄氏剂、灭蚁灵和滴滴涕在此次检测中均未检出（见表3）。32份孕妇血清样品中检出有β-HCH或PCBs单体，其中β-HCH平均浓度为474 ng/g lipid，低于Masuda等【18】在日本调查的结果（564 ng/g lipid）； 而∑PCBs的平均浓度为118 ng/g lipid，低于Voorspoels等【19】在比利时的调查结果（237 ng/g lipid），但高于Tan等【2】在新加坡的调查结果（29 ng/g lipid）。
References
1 de Boer J. Anal. Lett.， 2012， 45（5-6）： 485-494
2 Tan J，Loganath A， Chong Y S， Obbard J P. Toxico. Enviro. Chem.， 2008， 90（5）： 837-859
3 Haddad S，Poulin P， Krishnan K. Chemosphere， 2000， 40（8）： 839-843
4 Phillips D L， Pirke J L， Burse V W， Bernert Jr J T， Omar Henderson L， Needham L L. Arch. Environ. Contam. Toxicol.， 1989， 18（4）： 495-500
5 Jacobs M N，Covaci A， Gheorghe A， Schepens P. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（6）： 1780-1788
6 Wang P， Zhang Q， Wang Y， Wang T， Li X. Anal. Chim. Acta， 2010， 663（1）： 43-48
7 Tapie N， Budzinski H， Le Ménach K. Anal. Bioanal. Chem.， 2008， 391（6）： 2169-2177
8 PanM， Ma X D， Song S L， Zhang J X， Liu C， Guo X C. Anal. Lett.， 2014， 47（13）： 2173-2182
9 SONG Shu-Ling， HU Xiao-Jian， QI Peng， LI Song， TONG Ling， TIAN Qin， MA Xiao-Dong. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（1）： 49-54
宋淑玲， 胡小健， 祁 鹏， 李 松， 佟 玲， 田 芹， 马晓东. 分析化学， 2015， 43（1）： 49-54
10 Bergonzi R， De Palma G， Tomasi C， Ricossa M C， Apostoli P. Int. Arch. Occup. Environ. Health， 2009， 82（10）： 1241-1247
11 Orta-García S， Pérez-Vzquez F， Gonzlez-Vega C， Varela-Silva J A， Hernndez-Gonzlez L， Pérez-Maldonado I. Sci. Total Environ.， 2014， 472： 496～501. doi：10.1016/j.scitotenv. 2013.11.059
12 Labadie P， Alliot F， Bourges C， Desportes A， Chevreuil M. Anal. Chim. Acta， 2010， 675（2）： 97-105
13 Barker S A. J. Biochem. Bioph. Meth.， 2007， 70（2）： 151-162
14 Fidalgo-Used N， Blanco-Gonzlez E， Sanz-Medel A. Anal. Chim. Acta， 2007， 590（1）： 1-16
15 CHEN Xiao-Hua. Technology and Application of Solid Phase Extraction. Beijing： Science Press， 2010： 253
陈小华. 固相萃取技术与应用. 北京： 科学出版社， 2010： 253
16 Silva M G D， Aquino A， Dorea H S， Navickiene S. Talanta， 2008， 76（3）： 680-684
17 Yao Z， Zhang Y， Jiang G. Bull. Environ. Contam. Tox.， 2005， 74（1）： 155-161
18 Masuda Y，Haraguchi K， Kono S， Tsuji H， Papke O. Chemosphere， 2005， 58（3）： 329-344
19 Voorspoels S， Covaci A， Maervoet J， Schepens P. B. Environ. Contam. Tox.， 2002， 69（1）： 22-29
