甲烷氧化混合菌胞内PHB提取方法的优化

    王喆等

    摘 要:本文通过考察甜菜碱和EDTA二钠盐对PHB提取收率的影响,确定了甜菜碱和EDTA二钠盐在甲烷氧化混合菌胞内PHB提取工艺中的最优用量。

    关键词:PHB;甜菜碱;EDTA二钠盐

    PHB以其生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性以及在生物合成过程中可利用再生资源等特性,在药学、医学、农业、电子等领域具有独特而广阔的应用前景,但目前未能实现PHB的大规模工业生产[1,2]。本文通过考察甜菜碱和EDTA二钠盐对PHB提取收率的影响,确定甜菜碱和EDTA二钠盐在甲烷氧化混合菌胞内PHB提取工艺中的最优用量,提高收率,建立甲烷氧化混合菌胞内PHB提取的新方法:表面活性剂(甜菜碱)-螯合物(EDTA二钠盐)提取法,探索简单、无毒,无污染的新工艺提取PHB。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    混合菌群Methylococcus capsulatus HD6T从黑龙江省大庆油田富含沼气地区的土壤中培养筛选获得。

    1.2 PHB的氯仿提取法

    取发酵的菌液,4℃,9000r/min下离心10min,用蒸馏水洗涤2次,再次离心收集菌体,烘干至恒重。在菌体中加入浓度为80%甲醇水溶液搅拌, 60℃水浴1h。水浴后的菌体以转速9000r/s,温度4℃,离心15min。离心后收集细胞烘干。干细胞加入氯仿, 80℃水浴回流萃取1h。所得液体用分析滤纸进行过滤,用氯仿洗3次,旋转蒸发得到纯化的PHB,用浓硫酸法测定含量。

    1.3 浓硫酸法测定PHB含量

    浓硫酸与PHB 100℃时水浴10min,浓硫酸与PHB在加热时可以定量转化为巴豆酸,巴豆酸在235nm处有一最大吸收峰值,通过紫外分光光度计测定OD235值确定PHB的量。

    1.4 甜菜碱法提取PHB条件的优化

    表面活性剂甜菜碱(0.6-3mg),螯合物乙二胺四乙酸二钠盐即EDTA二钠盐(0-1mg),溶解于50ml去离子水中,用5mol/L的NaOH调节PH值至13,加入甲烷氧化混合菌干细胞,于50°C以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min,将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次,于70°C恒温干燥箱内烘干,纯化的PHB用浓硫酸法测定含量。

    以同一批培养的甲烷氧化混合菌干细胞为实验材料,先通过较准确的氯仿提取法提取PHB,再用甜菜碱法提取PHB,将甜菜碱法提取的PHB含量与氯仿法提取的PHB含量进行比较,考察甜菜碱法提取PHB的收率,确定甜菜碱法最佳提取条件。

    2 结果与讨论

    2.1 不同的甜菜碱对细胞干重比对PHB提取量的影响

    离心收集细胞,放于70°C恒温干燥箱内干燥,将干燥后的细胞在此条件下反应:表面活性剂(甜菜碱)对细胞干重比分别为 0.03、0.06、0.1、0.15、0.2、0.3,螯合物(EDTA二钠盐)对干重比为0.1:1,加入去离子水,pH值调至13,于50°C下以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min,将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次,于70°C恒温干燥箱内烘干。将烘干后得到的PHB与浓硫酸在100°C下水浴10min, 再测定OD235值,计算出PHB的含量,与氯仿法提取PHB的含量做比较,计算出提取收率。当表面活性剂(甜菜碱)对细胞干重比为0.09:1时,PHB的提取收率最大,为90.33%。

    2.2 不同的EDTA二钠盐对细胞干重比对PHB提取量的影响

    离心收集细胞,放于70°C恒温干燥箱内干燥,将干燥后的细胞在此条件下反应:表面活性剂(甜菜碱)对细胞干重比为0.1:1,螯合物(EDTA二钠盐)对干重比分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1,加入去离子水,pH值调至13,于50 ° C下以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min,将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次,于70°C恒温干燥箱内烘干。将烘干后得到的PHB与浓硫酸在100°C下水浴10min, 再测定OD235值,计算出PHB的含量,与氯仿法提取PHB的含量做比较,计算出提取收率。结果见图1,当螯合物(EDTA二钠盐)对干重比为0.08:1时,PHB的提取收率最大,为96.22%。

    3 结论

    通过用传统的氯仿提取法提取出的PHB含量为基准,采用 PHB含量相同的甲烷氧化混合菌干细胞为实验对象,以提取收率为指标,优化了甜菜碱-EDTA二钠盐的提取条件。当表面活性剂(甜菜碱)对干重比为 0.1:1,螯合物(EDTA二钠盐)对干重比为0.08:1时,提取收率最高。以此优化的甜菜碱和EDTA二钠盐用量,加入去离子水,pH值调至13,于50°C下以1200rpm的转速进行细胞破壁处理20min,将离心得到的沉淀物质用去离子水和丙酮各洗涤一次,于70°C恒温干燥箱内烘干,得到了纯化的PHB,从而建立了简单、无毒,无污染的甲烷氧化混合菌胞内PHB提取的新方法。

    参考文献:

    [1]Berger E, Ramsay B A, Ramsay J A, et al.PHB recovery by hypochlorite digestion of non-PHB biomass[J]. Biotechnology techniques, 1989,3(4):227-232.

    [2]Ramsay J A, Berger E, Voyer R, et al. Extraction of poly-3-hydroxybutyrate using chlorinated solvents[J]. Biotechnol.Tech, 1994,(8):589-594.

    [3]尹进,沈忠耀.利用噬菌体破细胞壁分离胞内产物的展望[J].生物工程进展,2000,20(6):9-13.

    [4]Berger E., Ramsay B.A., Ramsay J.A., and Chavaric[J], Brotechnology Techniques, 1989, Vol.3, No.4. :227-232.

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