雨生红球藻生长和虾青素积累条件的研究进展

    陶云莹++王巧晗++宫庆礼

    摘要：综述了雨生红球藻生长和虾青素积累的多种影响因素，包括环境因子（光照、温度、盐度、pH）、营养盐、维生素、微量元素及植物激素，以期为雨生红球藻的科学化养殖及利用提供参考。

    关键词：雨生红球藻；生长；虾青素积累；环境因子；营养盐；维生素；微量元素；植物激素

    雨生红球藻（Haematococcus plivialis）是绿藻门（Chlorophata）、绿藻纲（Chlorophyceae）、团藻目（Volvocales）、红球藻科（Haematococcaceae）、红球藻属（Haematococcus）的一种淡水单细胞绿藻[1]，它作为公认的天然虾青素的“浓缩产物”，在逆境环境胁迫下能迅速地积累虾青素，含量最高可达其细胞干重的4%以上[2]。所生产的虾青素是一种红色的类胡萝卜素酮化物[3]，被广泛地应用于养殖[4]、医药 [5]及保健[6]等行业。目前，国内外关于利用雨生红球藻生产虾青素的研究已有几十年的历程，取得了显著的研究成果。在培养过程中，雨生红球藻的生长和虾青素积累都会受到多种条件的影响。本文总结了雨生红球藻生长和虾青素积累影响因素的研究进展，以期为雨生红球藻的科学化养殖及利用提供参考。

    1环境因子对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

    1.1光照

    光照强度是雨生红球藻生长的重要因素。一般认为其生物量增长的适宜光照强度范围是50～90 μmol/（m2·s），光照强度过高则不利于雨生红球藻的生长。不同研究结果得出的雨生红球藻的最适宜的光照强度不同，You等认为80～120 μmol/（m2·s）为生长的最适光照强度[7]，而Christoph等则认为低于30 μmol/（m2·s）时有利于藻细胞的生长[8]。这可能是因为实验藻种的品系不同等造成的。另外，光照周期对雨生红球藻生长的影响和光照强度有关：高光强，连续光照和间隔光照都将抑制藻细胞的生长；低光强，连续光照更有利于其生长；中等光强，连续光照和间隔光照差别不显著[9]。

    光照对雨生红球藻中虾青素的积累也有显著的影响。蒋敏霞等实验表明160 μmol/（m2·s）下，获得最大虾青素产量[10]，多数研究学者支持高光强利于诱导虾青素的积累的观点，但光照强度过高也会导致藻细胞的大量死亡[11]。虽然高光强是虾青素合成的重要因子但非必要条件，在没有光照的异养条件下，雨生红球藻也能合成虾青素，只是合成速度较低[12]。Tomohisa等还用不同频率和强度的光诱导虾青素时发现，低频率脉冲光源能有效地提高虾青素产量[13]。还有研究表明红光比蓝光更有利于雨生红球藻的生长，而蓝光则更能促进虾青素的合成[14]。

    1.2温度

    当温度为20 ℃左右时，雨生红球藻的生长状态最佳；当温度高于30 ℃时，红球藻细胞的生长将受到限制，但有利于虾青素的积累。Tjahjono等报道在30 ℃培养条件下，雨生红球藻的虾青素产量是20 ℃条件的3.5倍[15]。他们认为是由于高温生成了更多的活性氧，而活性氧能诱导虾青素的积累。也有可能是高温影响了雨生红球藻的正常分裂生长，从而使虾青素的含量相对提高。另外，Tripathi等发现35 ℃能促进各种条件下雨生红球藻中虾青素的积累[16]。

    1.3pH

    雨生红球藻适宜生长在中性或弱碱性的环境中。目前普遍认为pH在7-8时适宜红球藻的生长繁殖。也有研究表明pH值5-10是雨生红球藻可耐受的酸碱范围[17]，姜悦等研究发现，雨生红球藻在pH为11的环境下仍能生长，但生长速度较慢[1]。另外，虾青素的含量和培养基环境中pH的变化有很大的相关性，Sarada R等认为pH为7时，虾青素的含量明显增高[18]。而张睿欣在研究异养培养下雨生红球藻虾青素积累中发现，在pH为10时，虾青素的含量最高[19]。

    1.4盐度

    盐度是影响微藻生长发育的重要因子。适当增加盐度能加快雨生红球藻孢囊的形成，促进虾青素的积累，但不利于藻细胞的生长繁殖，过高的盐度还会造成藻细胞的大量死亡[10]。目前，盐度促进雨生红球藻细胞中虾青素的积累的作用机制尚不清楚，Boussiba通过添加氯化钠使BG-11培养基的盐度增加0.8%时，能促进虾青素的积累[20]；而在同样的盐度条件，庄惠如等用BBM培养基培养雨生红球藻却无色素积累[21]。

    2营养盐及维生素对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

    2.1碳源

    雨生红球藻有光合自养、异养和混合营养生长三种营养类型[22]。韦韬等研究了不同二氧化碳浓度和硝酸钾浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响。结果表明，较高浓度的CO2（600×10-6）能够显著促进雨生红球藻的生长、光合作用的进行和虾青素的累积[23]。董袆婷在研究不同营养条件和环境因素对雨生红球藻CG-11生长和虾青素含量的影响时发现，添加0.5～1.0 g/L的乙酸钠或碳酸氢钠均能促进红球藻中虾青素的积累，较对照组分别提高20.53%和27.50%，但当浓度超过1.0 g/L时将对雨生红球藻的生长表现出明显的抑制作用[24]。

    2.2氮源

    氮对植物的生长发育有着重要的作用，是植物所必需的大量元素。Borowitzka报道了NO-3-N是雨生红球藻的最佳氮源形式[25]，而应巧兰等认为NH+4-N下雨生红球藻的生长速率高于硝态氮[26]。研究表明，适宜浓度的氮源将加快雨生红球藻的生长，高浓度的氮源则会抑制虾青素的合成，缺氮或低浓度的氮源将促进藻细胞中虾青素的积累。董袆婷研究表明雨生红球藻在完全缺乏氮或磷条件下，虾青素含量最高为生物量的3.69%，比对照分别提高了21.50%和2252%[24]；但有学者表示，氮源是虾青素合成所必需的元素，他们认为较高的细胞密度是雨生红球藻中虾青素大量积累的前提，而高密度生长则需要存在大量的氮源，来满足生长所需蛋白质的合成。

    2.3维生素

    张英等在研究维生素B1、B12对雨生红球藻营养生长和胁迫阶段各生长指标的影响时发现，添加ω（B12）=5×10-8维生素B12使雨生红球藻生长率、胁迫条件下的微藻存活率、以及虾青素产量分别比对照组提高21%、264%和43%以上[27]。另外，他们还得出单独添加维生素B1和B12的培养组中，孢子率会明显下降，这为降低虾青素的提取难度和提高虾青素的利用率提供了新的研究思路。

    3微量元素对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

    3.1铁

    李涛等研究了Fe3+对雨生红球藻生长及荧光特性的影响。研究表明，适合雨生红球藻CG-06株生长的Fe3+浓度为8.95 μmol/L， Fe3+浓度较高时，雨生红球藻的生长受到抑制，Fe3+浓度低于1.79 μmol/L将产生低铁限制[28]。

    3.2铜、锌、钴

    刘伟成等通过单因子试验和正交试验研究了Cu2+、Zn2+、Co2+三种微量元素离子对雨生红球藻生长的影响。结果表明，三种金属离子的最适浓度分别是2.0×10-8、3.4×10-7、6.0×10-7 mol/L， 且Cu2+和Co2+存在明显的交互作用[29]。

    3.3铈

    李哲等运用高效液相色谱分析法研究了稀土元素Ce3+对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响。结果表明，Ce3+的质量浓度为0.1 g/L时，细胞密度比对照组提高了34%，对生长的促进作用最佳；当Ce3+的质量浓度为1 g/L时，虾青素质量分数可达到细胞干重的3.2%，较对照组提高167%[30]。

    4外源激素对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

    植物的生长发育进程受到各种激素的调控，雨生红球藻也不例外，在它的生活周期中，植物激素也发挥着重要的作用。孟春晓等研究发现向MCM培养基中添加2 mg/L的ABA有利于虾青素的合成[31]，高水平的ABA可能是一种逆境胁迫因子，而雨生红球藻在逆境下能通过快速积累虾青素的自我保护机制来缓解胁迫压力。他们还研究表明一定质量浓度（5 mg/L）的GA3对雨生红球藻积累虾青素有显著促进作用，但质量浓度过高（20 mg/L）将会对红球藻细胞产生致死作用[32]。外源生长素对微藻细胞生长发育的影响已有不少的研究报道。高政权等实验结果表明生长素类似物NAA对雨生红球藻生长的影响也具有双重性，即低浓度能促进藻细胞生长和分裂，浓度过高则会抑制分裂甚至对细胞有致死效应，还发现0.05 mg/L的NAA能有效地促进红球藻中虾青素的积累[33]。许多学者从分子生物学的角度研究了雨生红球藻中虾青素合成的几个关键酶基因的转录调控机制，结果表明β-胡萝卜素酮化酶基因（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶基因（CRTR-B）的5上游侧翼序列中可能存在脱落酸反应元件（ABRE）、赤霉素反应元件（P-box）、茉莉酸甲酯反应元件、乙烯相关的顺式反应元件（ERE）和水杨酸反应元件（TCA-element），它们将影响基因自身的转录和翻译[31-37]。

    5展望

    目前国内外就雨生红球藻的研究已取得较大的进展，但仍存在亟需改善的技术瓶颈等问题。植物激素或生长调节剂在微藻培养方面已经得到了广泛的应用，添加适宜浓度的生长调节剂能促进雨生红球藻的生长，缩短培养周期，还能增加生物量和次生代谢产物的积累。与现有的物理或化学影响因子相比，植物激素具有用量小、效果好、安全高等优势，对提高经济效益有重要意义。

    参考文献：

    [1] 姜悦，陈峰.微藻生物技术[M].北京：中国轻工业出版社，1999

    [2] Margalith P. Z. Production of ketocarotenoids by microalgae[J]. Applied Microbiology Biotechnology，1999，51：431-438

    [3] Lorenz R T. Cysewski G R. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin[J]. Trends in Biotechnology，2000，18（4）：160-167.

    [4] Nelis H J， De Leenheer A P. Microbial sources of carotenoid pigments used in foods and feeds[J]. Journal of Applied Bacteriology，1991，70（3）：181-191.

    [5] Chew B P， Park J S. Carotenoid action on the immune response[J]. The Journal of Nutrition， 2004， 134（1）： 257S-261S

    [6] Guerin M， Huntley M E， Olaizola M. Heamatococcus antaxanthin： applications for human health and nutrition[J]. Trends in Biotechnology，2003，21（5）：210-216.

    [7] You C J， Chu W C， Young S Y. Combined effects of light intensity and acetate concentration on the growth of unicellular microalga Haematococcus pluvialis [J]. Enzyme and Microbial Technology，2006， 39： 490-495

    [8] Christoph H， Kay G， Marco X， et al. Effect of cultivation parameters on growth and pigment biosynthesis in flagellated cells of Haematococcus pluvialis[J]. Journal of Applied Phycology， 2001， 13： 79-87

    [9] 欧阳琴.雨生红球藻的培养及其虾青素提取[D].福州：福州大学，2004

    [10] 蒋霞敏，刘敏海，沈芝叶，等.温度、光照与盐度对雨生红球藻诱变株虾青素积累的调控[J].中国水产科学，2005（6）：714-719

    [11] Harker M.，Young A.J.， Inhibition of astaxanthin synthesis in the green alga H. pluvialis[J]. European Journal of Phycology，1995，30（3）：179-187

    [12] Kobayashi M， Kakizono T， et al. Effects of light intensity， light quality， and illumination cycle on astaxanthin formation in a green alga， H.pluvialis[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1992， 74 （1）：61-63

    [13] Katsuda T， Shiraishi H， Ishizu N， Ranjbar R and Katoh S， Effect of light intensity and frequency of flashing light from blue light emitting diodes on astaxanthin production by Haematococcus pluvialis[J] .Journal of bioscience and bioengineering，2008，105（3）：216-220

    [14] 吴霞，康瑞娟，丛威，等.转光膜在雨生红球藻养殖上的应用[J].过程工程学报，2006 ，6（6）：969～972

    [15] Tjahjono A.E， Hayama Y， et al. Hyper-accumulation of astaxanthin in a green-alga Haematococcus pluvialis at elevated temperatures[J]. Biotechnology letters.1994，16（2）：133-138

    [16] Tripathi U， Sarsda R， Ravishanker G A. Effect of culture conditions on growth of green alga- Haematococcus pluvialis and astaxanthin production[J]. Acta Physiololgy Plantarum，2002，24（3）：323-329

    [17] 殷明炎，刘建国，张京浦，等.雨生红球藻和虾青素研究评述[J].海洋湖沼通报，1998（2）：53-62.

    [18] Sarada R， Usha T， G. A. Ravishankar. Influence of stress on astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under different culture conditions[J]. Process Biochemistry， 2002， 37（6）： 623-627

    [19] 张睿欣.雨生红球藻细胞转化及虾青素的提取[D].青岛：中国海洋大学，2012

    [20] Boussiba S， Vonshak A. Astaxanthin accumulation in the green-alga Haematococcus pluvialis[J]. Plant and Cell Physiology.1991，32（7）：1077-1082

    [21] 庄惠如，施巧勤，卢海声，等.营养胁迫对雨生红球藻虾青素累积的影响[J].水生生物学报，2000，24（3）：208-212

    [22] Triphathi U， Sarada R， Ramachandra S， et al. Production of astaxanthin in Haematococcus pluvialis cultured in various media[J]. Bioresource Technology.1999，68（2）：197-199

    [23] 韦韬，顾文辉，李建，张波，等.不同碳氮浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响[J].海洋科学，2012，36（11）：55-61

    [24] 董祎婷.雨生红球藻CG-11积累虾青素的生态调控研究[D].广州：暨南大学，2007.

    [25] Borowitzka M.A， Huisman J.M， Osborn A. Culture of the astaxanthin-producing green alga Haematococcus pluvialis （i）： effect of nutrients on growth and cell type [J]. Journal of Applied Phycology，1991，3：295-304

    [26] 应巧兰，叶勇.影响雨生红球藻797株生长和虾青素积累的某些因素[J].应用与环境生物学报，2002，8（1）：56-60

    [27] 张英，蔡明刚，齐安翔，等.维生素B1、B12在雨生红球藻不同培养阶段的作用研究[J].厦门大学学报，2004，43：142-146

    [28] 李涛，李爱芬，张成武，等. Fe3+对雨生红球藻生长及荧光特性的影响[J].武汉植物学研究，2009，27（6）：643-649

    [29] 刘伟成，李明云，蒋敏霞，等. Cu2+、Zn2+、Co2+对雨生红球藻生长的影响[J].水产科学，2006，25（6）：283-286

    [30] 李哲，蔡明刚，黄水英，等. 稀土元素Ce对雨生红球藻生长和虾青素积累影响的研究[J].海洋科学，2008，9（32）：37-41

    [31] 孟春晓，高政权.外源脱落酸（ABA）对雨生红球藻中虾青素积累的影响[J].饲料与添加剂，2007（7）：68-69

    [32] 孟春晓，高政权.外源赤霉素对雨生红球藻中虾青素积累的影响[J].水产科学，2007，26（5）：249-254

    [33] 高政权，孟春晓，车青.添加萘乙酸（NAA）对雨生红球藻中虾青素积累的影响[J].饲料与添加剂，2007，11：59-62

    [34] Lu Y D， Jiang P， et al. Methyl jasmonate-or gibberellins A3-induced astaxanthin accumulation is associated with up-regulation of transcription of β-carotene ketolase genes （bkts）in microalga Haematococcus pluvialis[J]. Bioresource Technology，2010，101（16）：6468-6474

    [35] 高政权，孟春晓，刁英英.施用水杨酸对雨生红球藻中虾青素积累的影响[J].水产科学，2007，26（7）：376-380

    [36] 高政权，孟春晓.外源乙烯利对雨生红球藻中虾青素积累的影响[J].食品科学，2007，28（10）：376-380

    [37] 王鑫威，王丽丽，等.茉莉酸甲酯对雨生红球藻虾青素含量和dxs基因表达的影响[J].水产科学，2011，35（12）：1822-1828

    The study progress of Haematococcus plivialis growth

    and astaxanthin accumulation conditions

    TAO Yunying， WANG Qiaohan， GONG Qingli

    （College of Fisheries， Ocean University of China， Qingdao 26603， China）

    Abstract：This paper reviewed many factors of Haematococcus plivialis growth and astaxanthin accumulation， including environmental factors （light， temperature， salinity， pH）， nutrients， vitamins， trace elements and plant hormones， aim to provide a reference of scientific culture and use.

    Key words：Haematococcus plivialis； growth； accumulation of astaxanthin； environmental factors； nutrients； vitamins； trace elements； plant hormones